Biosense微生物动态监测系统应用：研究黑曲霉分生孢子混合物萌发的方法
曲霉菌属常见于食品中。例如，黑曲霉可以从大多数储存的商品中分离出来，而构巢曲霉、土曲霉和棒曲霉则可以在谷物和谷物产品中找到，曲霉菌也可能导致食物腐败。食品被曲霉分生孢子污染或接种。这些无性孢子大量产生，并通过风、水和昆虫等动物传播。休眠分生孢子的代谢活性较低，并且能够抵抗干旱、高温和低温、高盐、活性氧和紫外线等各种胁迫。食品基质中分生孢子的萌发包括活化、膨胀、细胞极性的建立和芽管的形成。膨胀和芽管形成阶段可以分别通过孢子体积的增加和圆形度的降低来区分。曲霉孢子的萌发受到各种环境因素的影响，包括温度、可用水量、光照、pH和CO2。当暴露于不同的营养条件时，不同曲霉的分生孢子具有不同的萌发动态。因此，当与其他曲霉一起在不同的培养基中生长时，曲霉属物种具有不同的竞争潜力。孢子密度也会影响曲霉菌的发芽率。增加黑曲霉或烟曲霉的孢子浓度会导致发芽率降低。然而迄今为止，尚未评估孢子密度对混合物种培养物中曲霉孢子萌发动态的影响。研究人员使用Biosense微生物生长动态监测系统开发出一种研究孢子混合物萌发的方法。研究发现黑曲霉分生孢子的萌发不仅受到其自身孢子密度的影响，而且还受到其他曲霉孢子密度的影响。这种效应有助于后续了解自然界中真菌的生长，但也可能为防止食品腐败、优化食品发酵过程以及在使用曲霉作为细胞工厂时生产酶和小分子提供线索。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
使用oCelloScope设备观察黑曲霉孢子的生长过程及对共培养物中黑曲霉孢子的鉴定。当黑曲霉的分生孢子与另一种曲霉菌混合存在时，可以通过oCelloScope分析进行区分。在t=1小时确定不同分生孢子的圆形度、表面积和对比度的差异。不同曲霉属物种的孢子圆形度之间没有可检测到的差异。萌发分析通过对oCelloScope设备进行观察分析。该设备在24小时内，每小时扫描总扫描长度≥405μm的最大数量1000个孢子。接种后1小时开始扫描，直到分生孢子沉降在板的底部。在t=1时手动去除邻近或聚集的孢子，以获得每个40-700像素（一个像素约为0.55×0.55μm）的物体区域一个分生孢子。使用时间间隔t=1到t=24内每个物体（每个孢子都有自己的物体ID）的圆形度和表面积作为输入，通过自定义R脚本将物体分类为静止分生孢子、肿胀分生孢子和萌发分生孢子。
实验结论
在大多数情况下，其他曲霉的孢子对肿胀和芽管形成的抑制作用比黑曲霉本身的密度更高。与黑曲霉相比，米曲霉、棒曲霉和构巢曲霉对精氨酸的发芽反应较高，而土曲霉则表现出较低的反应。在脯氨酸的情况下观察到类似的效果。与较高的黑曲霉密度相比，初级和/或次级代谢物的释放可能是其他曲霉存在更强的发芽抑制的原因。在丙氨酸和脯氨酸的情况下，这些化合物应该由休眠孢子释放，因为在这些氨基酸存在的情况下，它们通常不会比黑曲霉更快地发芽。相比之下，米曲霉、棒曲霉和构巢曲霉的幼体也可能在精氨酸中释放这些代谢物，因为它们确实对这种氨基酸表现出更高的发芽反应。在单一培养物和共培养物的孵育期间，培养基中的氨基酸浓度没有变化。竞争性曲霉对这种碳源和氮源的吸收并不能解释其他曲霉对黑曲霉萌发的强烈抑制作用。可能可以通过O2或CO2的竞争来解释。
图1、描述低密度（5000个孢子）和高密度（40000个）单一培养中黑曲霉分生孢子的膨胀和芽管形成的不对称模型的参数估计。P max、τ和d分别代表分生孢子膨胀或萌发的最大百分比、P=0.5 P max时的时间以及萌发反应的异质性程度。括号之间表示置信区间，N代表t=1 h时的对象数量，而M代表由于菌丝变得太长或该对象被其他对象的菌丝遮挡而不再检测到的对象数量。
图2、黑曲霉分生孢子在低密度（5000个孢子；以蓝色表示）和高密度（40,000个孢子；以红色表示）时丙氨酸(A)、脯氨酸(B)、和精氨酸（C）监测黑曲霉分生孢子的膨胀和芽管形成。图2A说明丙氨酸溶胀的Pmax在低密度（93.28%）下显着高于高密度（76.71%），但它们的τ相似（分别为5.27 h和5.43 h）。诱导氨基酸丙氨酸和脯氨酸存在的情况下，较高的黑曲霉孢子密度降低了肿胀和芽管形成的发生率，而这些氨基酸即使有影响，也不会高度影响肿胀和芽管的速率形成。
图3、黑曲霉(A)、土曲霉(B)、米曲霉(C)、棒曲霉(D)和构巢曲霉(E)的分生孢子图像以及面积和对比度散点图t=1小时时的曲霉分生孢子(F)。F中每个物种的样本量≥1200个分生孢子。
图4、黑曲霉和土曲霉(A)、构巢曲霉(B)、棒曲霉(C)和米曲霉(D)孢子的模拟共培养。浅色（欧几拉德距离分数50-90）和深色（欧几拉德距离分数>90）蓝点代表不与其他曲霉菌种群重叠的黑曲霉孢子。选择深蓝色点用于分析肿胀和芽管形成。黑点（欧氏距离分数<50）代表重叠，而红点（欧氏距离分数≥50）代表不属于重叠部分的其他曲霉菌的孢子。
图5、使用生物三次重复培养低（蓝线）和高（红线）黑曲霉孢子密度2天期间培养基中丙氨酸(A)、脯氨酸(B)和精氨酸(C)的浓度。误差线代表平均值的标准误差(SEM)。黑线代表黑曲霉分生孢子与米曲霉孢子的共培养。
总结
曲霉菌可以用来生产食物，但也会使食物变质。食品生产和腐败都是由这些真菌的分生孢子萌发引起的，这些真菌的分生孢子分别是通过接种和污染引入的。这些孢子的萌发包括激活、膨胀、细胞极性的建立和芽管的形成。到目前为止，仅进行了真菌孢子的定量单物种萌发研究。研究人员对单一培养物或与其他食品相关曲霉（构巢曲霉、土曲霉、棒曲霉和米曲霉）混合时食品腐败真菌黑曲霉的孢子萌发进行了定量研究。在存在发芽诱导氨基酸脯氨酸或丙氨酸的情况下，但在低诱导氨基酸精氨酸的情况下，当将35,000个额外的黑曲霉分生孢子添加到含有5000个的孔中时，肿胀和芽管形成的发生率降低。这些孢。在精氨酸存在的情况下，添加另一种曲霉的35,000个孢子对发芽也没有影响，但与添加丙氨酸的情况下额外的黑曲霉孢子相比，发芽抑制作用更强。脯氨酸也获得了类似的效果。结果表明，在有利的营养条件下，黑曲霉分生孢子的萌发受到其自身孢子密度和其他曲霉孢子密度的影响。这些结果增加了我们对真菌引起的食品腐败的理解，并可用于优化真菌食品生产。
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