基于ELISA和细菌生长曲线应用的结合定量检测肠炎沙门氏菌（一）
沙门氏菌属(salmonella)是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌［1，2］。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。国内外对食品中沙门氏菌的检测技术或检测方法研究并不鲜见［3-5］。这些方法大都都是对沙门氏菌的定性检测但是对沙门氏菌定量研究很少。目前，仅有SN/T0040-1992是沙门氏菌定量方法，原理是基于MPN法实现定量。SN/T0040-1992虽然可以定量检测但是缺点操作繁琐，需要稀释三个梯度或更多，每个梯度3管共9管，每个管都要进行阴阳性判断才能确定，耗时费力，同时，该方法由于从225 ml 10倍样品稀释液中取1 ml用来增菌培养存在漏检风险。本课题以肠炎沙门氏菌为例对沙门氏菌定量研究模型进行探讨，基于ELISA和细菌生长曲线应用的结合，研究沙门氏菌的定量，开发一种一种操作简单有效能够对样品中沙门氏菌本底含量检测的方法。
1材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1实验仪器:MiniVidas酶联免疫分析仪制造商生物梅里埃，恒温培养箱型号INE600制造商MEMMERT。
1.1.2培养基:缓冲蛋白胨水(BP)海博生物批号20120509，亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)海博生物批号20120506，四硫磺酸盐煌绿增菌液(TTB)海博生物批号20120309，亚硫酸铋琼脂(BS)海博生物批号20120417，DHL琼脂海博生物批号20120315，3M菌落总数测试片规格型号PertrifilimTM 6406批号2013-10TP。
1.1.3菌株:肠炎沙门氏菌株(salmonella enteritidis)3代，大肠杆菌(escherichia coli)3代(购置中国工业菌种保藏中心)，奇异变形菌(P.mirabilis)2代(实验室分离获得)
1.2方法
1.2.1标准菌株活化:以无菌操作将菌株滤纸片放入10 mm缓冲蛋白冻水试管中，36℃培养过夜;培养液划线接种平板BS，DHL培养24～48 h;挑去单菌落接种到盛有20 ml BPW的试管中培养18 h备用。
1.2.2菌液的梯度稀释及计数:10倍梯度稀释菌液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，分别将10-5、10-6、10-7、10-8稀释液1 ml接种测试片，每个梯度接种2片，放入培养箱36℃培养24～48 h后计数。
1.2.3酶联免疫分析仪测试值(荧光值)与沙门氏菌浓度函数关系建立:肠炎沙门氏菌株纯化后挑去单菌落接种于缓冲蛋白胨水中10～20 ml 36℃培养12～18 h，分别进行10倍稀释，5倍稀释，4倍稀释3倍稀释和2倍稀释。选取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1 000倍稀释液使用Vidas检测，同时使用3M细菌菌落计数测试片对培养液10-5，10-6，10-7进行计数。然后建立Vidas测试值与沙门氏菌浓度(取对数值)数学函数关系式。
1.2.4沙门氏菌在两种培养液中的生长曲线绘制:使用不同浓度沙门氏菌分别接种TTB(1、10、50、150、380 cfu/ml)、SC(0.58、5.8、20、58、200、580 cfu/ml)增菌液100 ml于42℃和36℃培养间隔1或2 h取样，使用测试片对沙门氏菌计数，培养至16～20 h。绘制不同接种浓度沙门氏菌在两种培养液中的生长曲线。
1.2.5生长曲线对人为污染样品的检测:选用样品常温和冷鲜猪和鸡肉25 g进行人为污染，放入25 ml增菌液均质1 min，然后加入剩下的200 ml增菌液置于36℃和42℃培养，分析建立的方法对人为污染样本检出的的误差。
1.2.6干扰试验:选择大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，单核细胞增生李斯特氏菌，变形杆菌作为干扰菌。设置两组相同的样品，第1组如同验证试验部分，只添加一定浓度的肠炎沙门氏菌到样品中，第2组在第1组的基础上添加干扰菌混合液包括大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，单增李斯特氏菌和变形杆菌，每种干扰菌的添加量均是目标菌10倍以上。操作同验证试验部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas对增菌液检测。每种干扰菌的添加量均是目标菌10倍以上。操作同验证试验部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas对增菌液检测。
基于ELISA和细菌生长曲线应用的结合定量检测肠炎沙门氏菌（一）
基于ELISA和细菌生长曲线应用的结合定量检测肠炎沙门氏菌（二）