青藏高原冻土区培养基分离解磷菌的生长曲线测定
本研究以青藏高原多年冻土区土壤为研究对象，利用有机磷和无机磷选择性培养基分离解磷菌，通过测定菌株的溶磷圈、菌液中pH和上清液有效磷含量等指标分析解磷菌的解磷能力，结合不同干旱梯度和温度梯度培养实验评价菌株的抗逆能力，以期为解决青藏高原冻土区磷限制问题提供优良的菌株资源，将对干旱半干旱冻土区生态恢复具有重要意义。
研究区域和样品采集
研究区域位于西藏自治区那曲市安多县唐古拉山口附近(32°33′10.66′′N,91°50′3.97′′E)，是典型多年冻土分布区。该区域海拔5 100 m，全年大风日约100 d，年均降水量293–430 mm，年均气温−1.3–2.9℃[18]。区域内主要植被为紫花针茅(Stipa basiplumosa)、火绒草(Leontopodium leontopodioides)、羽柱针茅(Stipa subsessiliflora)、青藏苔草(Carex moorcroftii)和垫状驼绒藜(Krascheninnikovia compacta)。土壤发育程度较低，多为石灰性土。
2022年8月，在唐古拉山口附近，距109国道垂直距离100–150 m范围内采集0–10 cm的土壤样品。通过五点取样法采集2 kg土样，并按四分法对采集的土样进行混匀。混匀后的土样分成2份：一份4℃保存用于解磷菌株分离；另一份土样风干后过2 mm筛，用于全量养分测定。土壤pH值为8.2，有机碳含量为4.31 g/kg，全氮含量为3.08 mg/kg，全磷含量为0.53 g/kg。
1.2培养基
无机磷选择性液体培养基(g/L)[19]：葡萄糖10.00，Ca3(PO4)2 5.00，(NH4)2SO4 0.50，NaCl 0.30，KCl 0.30，MgSO4·7H2O 0.30，FeSO4·7H2O 0.03，MnSO4·4H2O 0.03，酵母浸粉0.50，pH 7.0–7.5。
有机磷选择性液体培养基(g/L)[20]：葡萄糖10.00，植酸钙5.00，MgCl2·6H2O 5.00，MgSO4·7H2O 0.25，KCl 0.20，(NH4)2SO4 0.10，pH 6.8–7.0。
肉汤培养基(LB)(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母浸粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0–7.2。
固体培养基：在液体培养基中加入15.0 g/L琼脂。
在进行实验前，上述所有培养基以及实验过程中所需的蒸馏水和涂布器等需要121℃灭菌20 min。
菌株生长曲线绘制
取OD600为0.1的菌悬液1 mL，转接于50 mL的LB液体培养基中，在5、10、15、20、30℃条件下振荡培养(180 r/min)，测定不同培养时间下菌液的OD600值，并分别以培养时间和OD600值为横坐标和纵坐标绘制菌株生长曲线。
菌株生长曲线特征
菌株在不同培养温度下的生长曲线如图1所示。在30℃时，5株解磷菌在培养12–22 h后进入稳定期(图1A)。在10、15、20℃时，i6、i9L、Qb和Qo在培养50 h后进入稳定期(图1B、3C、3D)。在5℃时，i6、i9L、Qb和Qo进入到稳定期大约需要培养100 h，i5则需要培养140 h左右进入稳定期(图1E)。进入稳定期的5株解磷菌OD600值比较结果显示：Qb和Qo的OD600值在5–20℃时高于i5、i6和i9L的OD600值，在30℃时则低于i5、i6和i9L的OD600值。不同培养温度下，进入稳定期的Qb和Qo的OD600值在15℃时最高(图1)。
图1五株解磷菌的生长曲线
结论
本研究利用选择性培养基从青藏高原多年冻土区土壤中筛选出3株解无机磷菌(i5、i6和i9L)和2株解有机磷菌(Qb和Qo)。基于16S rRNA基因系统发育分析结果表明，5株解磷菌均为假单胞菌属(Pseudomonas)。然而，5株菌在解磷能力、抗干旱和耐低温能力等方面存在显著的差异。通过解磷菌的溶磷指数、上清液pH和有效磷含量的测定，揭示了Qb和Qo解磷能力强于i5、i6和i9L的解磷能力。通过PEG6000模拟干旱胁迫处理以及低温培养实验发现，菌株Qo较其他菌株具备更强的耐干旱和低温的能力。本研究将为青藏高原多年冻土区土壤难利用性磷活化提供重要菌株资源，对于支撑青藏高原冻土区土壤修复和植物生长具有重要意义。
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