HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞增殖与生长（摘要、试验方法）
氧是生命活动中所必需的物质，且在其中起重要作用[1]。缺氧在恶性肿瘤中是较为常见的，且缺氧还是肿瘤生长环境最显著的特征之一[2]。组织和细胞是通过缺氧诱导因子（Hypoxia inducible factor，HIF）诱导相应靶基因来适应氧气浓度[3]。HIF-1、HIF-2及HIF-3是HIF的3种亚型，均由氧调节型α亚基和组成型β亚基构成，α亚基是活性亚基，又分为HIF-1α，HIF-2α和HIF-3α[4]。HIF-1α与氧浓度的关系密切，HIF-1α是缺氧细胞基因表达的关键，其稳定性和活性受各种翻译后修饰、羟基化、乙酰化和磷酸化的调节[5]。HIF-1α成为许多适应低氧微环境疾病的主要参与者，如癌症、中风和心脏病[6]。因此，阻断HIF-1α的表达或阻断其相互作用的蛋白质会抑制肿瘤生长[7]。HIF-1α在肿瘤组织中表达增高，一方面与肿瘤组织增生过快造成局部组织缺氧有关，另一方面，HIF-1α是多种依赖氧张力的调节因子[8]，与某些癌基因激活或抑癌基因失活有关。因此，HIF-1α的表达量可作为检测恶性肿瘤的标准。
黑色素瘤来源于黑色素细胞，是一种具有侵袭性的皮肤癌[9-10]。黑色素瘤虽然发病率不高，但其死亡率较高[11-12]。黑色素瘤多发于哺乳动物皮肤和黏膜，均具有侵袭性和致死性，且预后差[13-14]。HIF-1α的表达与肿瘤的发生发展有关，研究其在黑色素瘤发病和发展机制中的作用对于改善患者的临床结果至关重要[15]。HIF-1α介导不同过程的基因转录，包括应激适应、代谢、凋亡、肿瘤生长、血管生成和侵袭[16]。近年来研究还发现，HIF-1α参与了PI3K/Akt/mTOR、Ras/RAF/MEK/ERK、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、Notch等信号通路[17-18]，这些路径及其相关的复杂变化影响黑色素瘤的生长和发展、新陈代谢、运动和细胞凋亡[19]。
传统抗体药物分子较大，结构复杂，较易失活且价格昂贵。纳米抗体的优势在于分子小、渗透性强，能够针对传统单抗所不能触及的抗原表位设计药物，使其更好地到达肿瘤内部以及穿透血脑屏障[20]。因此，基于HIF-1α表达受到抑制将发挥抗肿瘤功能，结合纳米抗体的优势，本研究以羊驼源黑色素瘤B16噬菌体文库制备HIF-1α纳米抗体，并验证其在黑素瘤的生长和发展过程中的作用，旨在为抑制肿瘤生长提供新思路。
1材料和方法
1.1试验材料
大肠杆菌TG1、辅助噬菌体M13K07、B16细胞和羊驼源黑色素瘤B16噬菌体文库、正常小鼠脑组织切片均由山西农业大学羊驼生物工程实验室保存提供。HIF-1α多肽购自武汉三鹰生物科技有限公司。
1.2试验方法
1.2.1 HIF-1α纳米抗体的筛选将HIF-1α多肽稀释至终质量浓度为20μg/mL，包被免疫管，4℃静置过夜，以备用。将TG1接种于5 mL 2YT培养基中，37℃、200 r/min过夜振荡培养以活化。
将500μL噬菌体文库溶于100 mL 2YT/AG溶液培养基中，37℃、200 r/min振荡培养至D600nm值为0.4～0.6；加入100μL辅助噬菌体，混匀静置30 min，再37℃、200 r/min振荡30 min，弃上清，加入100 mL 2YT/AK液体培养基重悬沉淀，30℃、200 r/min振荡培养至过夜。次日，将TG1接入30 mL 2YT中，37℃、200 r/min培养至D600nm=0.4备用。4℃、11 000 r/min离心10 min，去上清加入1/5体积遇冷的PEG/NaCl，冰上放置70 min。离心后用2.4 mL无菌PBS重新悬浮菌体沉淀，再次离心，回收上清加入事先包被20μL/mLHIF-1α多肽的免疫包被管中。37℃封闭1 h后用PBS冲洗，并加入三乙醇胺，缓慢振荡15 min，加入Tris-HCl中和。将其涂布于2YT/AG平板，30℃培养过夜。次日收集菌落，作为HIF-1α一级文库。
按上述方法，分别以10、5、2.5μg/mL的HIF-1α质量浓度进行第2轮、3轮、4轮的淘筛。从第4轮筛选洗脱物滴定的平板上，随机挑取96个单克隆接种于2YTAG中与30℃振荡培养8 h，加入稀释的噬菌体，37℃振荡培养1 h后离心，弃去上清用含有Kana抗性的培养基重悬沉淀，37℃过夜培养。
将HIF-1α蛋白和BSA蛋白包被于96孔板，用ELISA法筛选阳性克隆并进行测序，比对测序结果，在NCBI基因库中选择VHH序列并用DNAMAN进行比对和ORF Finder软件进行氨基酸序列分析，选取能够完整表达蛋白质的菌株，进行后续试验。
1.2.2载体的构建按阳性克隆的DNA序列设计引物（含BamHI、SalI酶切位点）：HIF-1α-F：5'-CGGGATCCGAGTCGGGAGGAGGCTTGG-3'；HIF-1α-R：5'-GCGTCGACTGAGGAGACGGT GACTAGGG-3'。
PCR扩增反应体系为50μL：2×Es Taq Master Mix 25μL，上下游引物各2μL，模板5μL，ddH2O补至50μL。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35个循环；72℃延伸10 min。
PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳胶回收，将回收产物和PMD19-T连接，PMD-19T反应体系为：PMD-19T 1μL，回收产物4μL，Solution Buffer 1μL。之后再以BamHI、SalI将19TNbHIF-1α和pET-28a进行双酶切并进行T4连接（双酶切体系为：10×QuickCut Buffer 5μL，BamHⅠ1μL，SalⅠ1μL，19TNbHIF-1α质粒8μL，ddH2O 35μL；T4连接体系为：回收菌体质粒6μL，回收载体2μL，T4连接酶1μL，T4Buffer 2μL，ddH2O 9μL，将连接产物转化至E.coliDH5α，涂布于含100μg/mL Kana的LB平板上37℃培养过夜，挑取单克隆接种于LB-Kana液体培养基摇至D600为0.4～0.6后测序，将测序结果正确的质粒命名为pET28a-NbHIF-1α。
1.2.3 HIF-1α纳米抗体表达与纯化将5μL pET28a-NbHIF-1α提取质粒，将该质粒转入BL21（DE3）中，冰浴30 min，42℃热激45 s，再冰浴3 min，37℃、200 r/min振荡活化1 h，菌液接种于LBKana液体培养基中，37℃、200 r/min振荡至D600为0.6，加入0.3 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），28℃、200 r/min摇菌4 h后收菌，将菌液沉淀用PBS清洗2次后超声破碎，16 000 g离心30 min。使用AKTA层析系统与镍离子金属螯合亲和层析介质（Ni-NTA）预装柱对带有His标签的纳米抗体进行纯化，分别用不同梯度咪唑和分子筛除去杂蛋白，将蛋白用超滤管浓缩后分装，-80℃保存。
1.2.4 HIF-1α纳米抗体的应用将6周龄正常小鼠脑组织研磨后提取总蛋白后进行SDS-PAGE电泳，将纯化的HIF-1α纳米抗体作为一抗、HRPHis-Tag作为二抗进行Western Blot检测脑组织中HIF-1α蛋白的表达。
将制备的小鼠脑组织制备石蜡切片经脱蜡、抗原修复，然后在3%双氧水中室温孵育30 min。用PBS洗涤后，用5%BSA在37℃封闭1 h，然后与纯化的纳米抗体或PBS（空白对照）孵育，之后于37℃在His-tag抗体孵育1 h。DAB显色，随时观察停止显色，然后用苏木精复染，脱色封片，检测小鼠脑组织中HIF-1α表达分布。
1.2.5 HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞增殖的影响待B16细胞在培养皿中长到80%～90%，与HIF-1α纳米抗体加入96孔板中，并保证每孔2 000个，37℃、5%CO2培养箱中待6 h后，在每孔中加入10μL CCK-8工作液，检测0、3、6、9 h的450 nm波长的吸光度。
1.2.6 HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞迁移的影响将培养到80%～90%的B16细胞传代至12孔板中，待细胞长满12孔板后，使用直尺与100μL枪头在12孔板划平行线，用PBS缓冲液洗净残留细胞。试验组加入HIF-1α纳米抗体。分别在划痕0、12、24、36 h后对同一位置进行拍照，观察细胞迁移结果。
1.2.7 HIF-1α纳米抗体对增值相关蛋白表达的影响选取培养状态良好且培养到80%～90%的丰度，细胞传代到6孔板中，试验组和对照组各3个孔。试验组中加入HIF-1α抗体，放入培养箱中进行过夜培养。培养至对数生长期，收集细胞，提取细胞总蛋白。用所提蛋白进行Westen Blot检测，以β-actin为内参，检测细胞中Ras、RAF1、ERK1/2、RAC1和VEGF蛋白表达量。