HIF-1α纳米抗体对黑素瘤细胞增殖与生长（结果与分析、结论）
2结果与分析
2.1 HIF-1α纳米抗体的筛选及序列特征
通过对阳性克隆的序列进行比对，筛选出6个VHH序列。经过ELISA法对6个阳性克隆进行抗原结合力检测，选取1A12作为候选克隆（表1）。1A12的核苷酸序列与NCBI数据库中的VHH序列相似性达到78%，通过对1A12克隆的氨基酸序列分析，发现该序列没有形成跨膜区，为亲水性蛋白。1A12的氨基酸序列由88个氨基酸构成，含有完整的4个框架区（FR1～FR4）和3个高度可变抗原结合区即互补决定区（CDR1～CDR3），其中CDR3是抗原特异性识别的区域，含有11个氨基酸。
表1 HIF-1α单克隆ELISA筛选结果
2.2纳米抗体表达、纯化与结合性检测
以挑选出的VHH（1A12）序列质粒为模板进行PCR，扩增出大小约为400 bp的VHH片段（图1-A）。将VHH片段与PMD19-T连接后再连接到pET-28a表达载体上以构建质粒（图1-B）。
图2质粒的构建
构建的质粒经原核表达和纯化后，用考马斯亮蓝染色以及Western Blot进行鉴定，结果发现，考马斯亮蓝染色得到的条带较单一；Western Blot检测发现大小约为16 ku的特异性条带，说明该蛋白为表达所得的特异蛋白。
选取小鼠脑组织，免疫组织化学一抗试验组用HIF-1α纳米抗体，用PBS作对照，可看出大脑组织中的免疫阳性信号，由此可见，HIF-1α纳米抗体可以与抗原HIF-1α结合，用于HIF-1α的组织定位。
Western Blot试验中一抗用纯化所得的HIF-1α纳米抗体，选取小鼠脑组织提取蛋白，结果显示，HIF-1α纳米抗体作为一抗可以与抗原HIF-1α结合，检测到特异性的免疫阳性条带，分子质量约为100、120、130 ku，说明脑组织中表达HIF-1α。由此可知，制备的HIF-1α纳米抗体可用于Western Blot试验的一抗以检测组织中HIF-1α抗原表达的相对定量。
2.3 HIF-1α纳米抗体对黑色素瘤细胞增殖、迁移及其相关蛋白表达的影响
将HIF-1α纳米抗体加入B16细胞培养基中，用CCK-8法检测并观察对B16细胞增殖的影响，结果显示，在HIF-1α纳米抗体作用下，在3～9 h内，加入HIF-1α纳米抗体的B16细胞表现出了抑制效果（图2-A）。将HIF-1α纳米抗体加入B16细胞培养基中，用细胞划痕试验检测HIF-1α纳米抗体对B16细胞迁移的影响。B16细胞在培养0、12、24、36 h检测，在12 h时已出现抑制细胞迁移现象（图2-B）。
图4 HIF-1α纳米抗体对B16细胞增殖、迁移及其相关蛋白表达的影响
在CCK-8法检测HIF-1α纳米抗体抑制B16细胞增殖的基础上，提取HIF-1α纳米抗体处理15 h后的B16细胞总蛋白，用Western Blot检测VEGF、RAS、ERK、RAC和RAF蛋白的表达量，与对照组相比，HIF-1α纳米抗体处理B16细胞后其蛋白量均呈下降趋势（图2-C、D）。
3结论与讨论
HIF-1α亚基是碱性-环-螺旋（basic-helixloop-helix,Bhlh）–PAS（per/ARNT/Sim，PAS）)超家族成员之一[21]，HIF-1α位于多种致癌和抑癌途径的交汇点，包括PI3K/AKT和MAPK/ERK信号通路，而这些信号通路是分子信号网络的核心，控制着许多细胞的生长、增殖、分化和生存，而肿瘤组织常高表达HIF-1α[22-23]。通过多种方式抑制HIF-1α的表达有望成为治疗黑色素瘤的方法。
本研究通过已建立的羊驼源黑素瘤噬菌体文库，以HIF-1α多肽进行4轮淘筛，筛选出1株阳性单克隆菌株，经过原核表达载体构建并诱导表达目的蛋白，镍柱纯化得到HIF-1α纳米抗体。所得的纳米抗体抗原特异性识别区域CDR3含有11个氨基酸残基超过了传统抗体CDR3的平均长度（7～9个氨基酸残基），可增大与抗原的接触面积，因此其与抗原具有较好的亲和性。VEGF家族是一类血管调节因子[24]，新生血管生成是肿瘤转移的潜在机制之一，血管参与加速肿瘤生长、促进肿瘤转移等过程[25]。在黑素瘤细胞中，HIF-1α纳米抗体穿过细胞膜进入胞质中，与HIF-1α结合后，抑制VEGF下游靶基因表达，并抑制Ras信号路径中关键基因的表达，同时使黑素瘤细胞中ERK和P-ERK表达下调，ERK是丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成员之一，该酶被激活后，成为磷酸化的ERK（P-ERK）。p-ERK可以介导信号由胞浆向胞核传递，参与调节细胞的生长、发育、分化、分裂等多种生理过程，其异常表达在细胞的恶性转化和肿瘤的发生发展中起重要作用[26]。并且发现HIF-1α纳米抗体在黑素瘤细胞中引起RAF1表达下调，通过PLC-γ-PKC-Raf-MEKMAPK信号通路使细胞增殖和迁移速度下降[27]。此外，在肿瘤组织中，由于新生血管管壁仅有1层内皮细胞，缺乏基底膜，内皮细胞间常有裂隙，同时VEGF本身可提高血管通透性，并刺激内皮细胞释放胶原酶使肿瘤细胞与肿瘤组织分离脱落，为肿瘤的转移创造了条件[28]。因此，HIF-1α纳米抗体在黑素瘤组织中可能会通过抑制血管形成而成为抑制肿瘤生长和发展的新材料。
本研究获得的HIF-1α纳米抗体分子质量约为16 ku，没有跨膜结构，具有亲水性。HIF-1α纳米抗体在构建原核表达载体时加入了His标签，将HIF-1α纳米抗体作为Western Blot和免疫组织化学技术中的一抗，与组织细胞中的HIF-1α特异性结合，使用HRP-His-tag抗体作为二抗，来检测HIF-1α在组织中的含量及分布。将自备的HIF-1α纳米抗体作用于B16细胞时，HIF-1α纳米抗体与HIF-1α结合，直接影响下游靶基因VEGF，并引发该信号通路的下调，抑制B16细胞的增殖和迁移，揭示其可能在黑色素瘤增殖、侵袭和转移中发挥着较为重要的作用，可作为基因治疗黑色素瘤的靶点。