酿造产香鲁氏接合酵母耐温、耐盐的营养需求特点与逆境响应差异
鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一种重要的产香食品酵母，在酱油酿造中发挥着重要作用，也是食品腐败微生物之一。长期以来，鲁氏接合酵母具备两种截然相反的特点，对高浓度盐的高耐受性和对高温的高敏感性。该酵母的耐盐机理备受研究者的关注，明确了高盐下酵母细胞的生理变化特点，筛选和鉴定出一系列耐盐相关基因和蛋白。然而，鲁氏接合酵母耐温、耐盐特性差异研究较少，影响了双重抗性优良菌株的构建。
湖北工业大学生物工程与食品学院的刘梦奇、闫珍珍、李欣*等针对酿造产香鲁氏接合酵母，确定了全合成最少营养组分的培养基，基于此探索酵母细胞在长时期（120 h）的高盐（18%NaCl）和高温（40℃）胁迫下对营养需求特点，并进一步研究从适应期到对数生长初期的有机酸代谢、氨基酸代谢、胞内相容抗逆物质和重要逆境响应调控基因表达等方面的两种逆境响应差异。
建立全合成最低营养生长培养基
为了规避逆境非必要营养物质对代谢分析和基因表达分析的干扰，同时也为寻找逆境必须营养物提供干净的背景，以YNB为对照培养基和出发培养基，选取酵母最适葡萄糖为唯一碳源，以脯氨酸为唯一氮源，采用单因素递减策略对微量元素进行评估，建立鲁氏接合酵母最低营养需求的全合成培养基。鲁氏接合酵母在全合成培养基中及其不同逆境下的生长曲线如图1A所示。
鲁氏接合酵母2013310在YNB培养基培养120 h的最大OD600nm达到31.01±0.72，而在全合成培养基中培养120 h最大OD600nm只有14.22±1.23。同时，该酵母在全合成培养基的高温和高盐逆境下培养120 h的最大OD600nm只有2.44±0.13和3.87±0.12。此外，与YNB培养基相似，酵母细胞在全合成培养基中的生长曲线也显示出清晰的适应期（0～12 h）、增殖期（12～84 h）和稳定期（84～120 h）。由此可见，全合成培养基能满足鲁氏接合酵母在正常生理环境下的生长增殖需求。鲁氏接合酵母在高盐逆境下需要大约36 h适应环境，而在高温环境下的适应期只有大约2 h。同时，在48 h时，高盐逆境下的鲁氏接合酵母进入了对数生长前期，而高温下的酵母细胞在4 h已经处于对数生长前期。可见，该酵母对高温环境的适应能力比高盐逆境好。鉴于鲁氏接合酵母在两种逆境下的不同生长曲线，高温逆境前12 h和高盐逆境前48 h（适应期和对数生长初期）被用来研究鲁氏接合酵母对两种逆境的响应差异。
通过扫描电镜观察鲁氏接合酵母2013310在全合成培养基及不同逆境下的形态学差异（图1B）。在全合成培养基培养下，鲁氏接合酵母菌体主要呈圆形的单细胞状态（与正常状态下酵母形态一致），部分表面有褶皱，有明显的出芽现象。发酵24 h后菌体全部呈圆形或椭圆形，表面圆润饱满，光滑无褶皱。在高盐条件下，酵母在48 h对数前期细胞缩小，表面出现严重的褶皱变化，大部分呈单细胞存在。在高温条件下的酵母在发酵8 h后，细胞大小较全合成培养基0 h较为接近，但存在部分细胞表面出现褶皱，且分布似乎有絮凝的趋势，这可能与高温对酵母细胞壁蛋白质结构影响有关。高盐胁迫比高温胁迫对全合成培养基培养条件下酵母细胞形态影响更为显著；而相对于高温逆境，该酵母在高盐条件展现出更高的生长活性。
鲁氏接合酵母逆境条件下的营养需求差异
酵母细胞对营养物质的获取只有两条途径，自身合成或转运外源营养物。微生物基因表达和代谢在逆境下会发生剧烈变化，对营养物的需求应该会发生相应的调整。考虑到高温逆境和高盐逆境可能会关闭某些营养物的自身合成途径，使得酵母细胞对营养物获取的方式发生变化，因此，分析全合成培养基中8种有机酸、7种维生素、7种核苷类物质和14种氨基酸对酵母细胞生长的影响，将有助于阐明鲁氏接合酵母在面对高温逆境和高盐逆境时的营养需求差异。
高盐逆境下的鲁氏接合酵母2013310的生长不需要额外有机酸，但丙酮酸和草酰乙酸却能促进高温逆境下酵母细胞的增殖，较对照分别提高了34.5%和24.2%（。无论是高盐还是高温逆境，鲁氏接合酵母2013310对丙酸和正丁酸敏感。这两种有机酸几乎完全抑制了高盐逆境下酵母细胞的生长。高温逆境下，添加丙酸、正丁酸的鲁氏接合酵母2013310 OD600nm较对照（OD600nm＝2.81）分别降低了85.1%、74.0%。高盐逆境下，不同类型维生素对鲁氏接合酵母高盐胁迫下生长无显著效果；高温逆境下，维生素的添加，在整体上促进了菌体生长，其中添加硫胺素菌体OD600nm较对照（OD600nm＝2.51）提高了1.47倍。不同类型核苷酸在两种条件下对鲁氏接合酵母2013310生长均无显著影响。
氨基酸的添加对高盐和高温胁迫下的鲁氏接合酵母2013310生长有明显影响。高盐逆境下，蛋氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸均能缓解菌体所受高盐胁迫，OD600nm较对照分别提高2.72、3.40、2.73倍和2.42倍；高温逆境下，能缓解细胞所受胁迫的氨基酸有赖氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、亮氨酸和精氨酸，其OD600nm较对照分别提高52.0%、31.1%、49.2%、34.5%、66.2%、19.4%和57.1%。丝氨酸和半胱氨酸均并不利于鲁氏接合酵母2013310耐受高盐和高温胁迫。
总体而言，遭遇高盐压力的鲁氏接合酵母细胞更需要外源氨基酸，而补充维生素和氨基酸有助于缓解酵母细胞的高温压力。这些结果也表明，鲁氏接合酵母的维生素和氨基酸自我合成代谢被高温压力所抑制。同时，谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸是鲁氏接合酵母细胞在两种环境压力下均需要的氨基酸。缬氨酸和蛋氨酸是鲁氏接合酵母细胞在高盐压力下生长所需的独特氨基酸，而赖氨酸、天冬酰胺和精氨酸是高温压力下鲁氏接合酵母细胞所需的独特氨基酸。由于氨基酸是蛋白质的重要组成单位，蛋白质又参与酶的形成、物质的转运及稳定细胞结构等，这表明有必要从蛋白层面进一步研究鲁氏接合酵母对高盐和高温压力响应的机理。
高盐和高温胁迫下鲁氏接合酵母胞内外代谢物差异
有机酸具有多重生理功能，也参与了生命体核心代谢途径，如丙酮酸溢流代谢和三羧酸循环。在选取的6种被检测有机酸物质中，两种逆境下的鲁氏接合酵母2013310细胞的胞内均只有乙酸被检测到，而且变化过程相似。乙酸在细胞生长适应前期（高盐的12 h，高温的2 h）在细胞内大量积累，最高含量分别达到（78.60±3.23）µg/g（细胞干质量，下同）和（126.30±10.56）µg/g。在随后的12 h（高盐）或2 h（高温），胞内乙酸水平大幅下降，分别降为（19.54±3.56）µg/g（高盐，24 h）和（38.30±7.02）µg/g（高温，4 h）。此后，乙酸含量几乎维持稳定。
在高盐逆境下也只检测到单一的胞外有机酸乙酸。乙酸在生长前期（0～12 h）快速积累并在12 h达到峰值（（364.09±15.65）µg/L），24 h后乙酸被快速消耗至（117.09±17.01）µg/L（36 h）。在高温下，除了乙酸，胞外还存在多种有机酸，包括正丁醇、丙酮、丙酸、丁酸和异丁酸。除乙酸外，5种有机酸在培养的前2 h就完成了胞外的积累。乙酸在胞外持续积累，最大质量浓度达到（566.32±13.76）mg/L（10 h）。乙偶姻是一种酮类物质，是鲁氏接合酵母在胞外积累的第二大化合物。乙酸代谢可能在鲁氏接合酵母长期适应高温高盐压力中起着重要的作用，是有机酸代谢的关键环节。推测乙酸的存在有利于乙酰辅酶A的合成，因为乙酰辅酶A是一种重要的抗逆中间代谢物。同时，考虑到全合成培养基的特点，胞外有机酸的出现源于胞内有机酸代谢及其分泌。相比于高盐压力，糖代谢在高温压力下更活跃。可见，鲁氏接合酵母针对高盐和高温逆境采用了不同的有机酸代谢策略。无论是高盐还是高温胁迫，鲁氏接合酵母均不会在胞内积累有机酸，这应该是避免有机酸的伤害，与前面营养需求研究结果一致。
高盐和高温胁迫下鲁氏接合酵母抗逆代谢物的差异
微生物合成抗逆代谢产物来抵御环境压力是一种重要的压力响应机制。鲁氏接合酵母胞内糖代谢对高盐和高温逆境产生了两种截然不同的响应。高盐逆境下的鲁氏接合酵母细胞内只有鼠李糖和半乳糖。在适应初期的12 h，酵母细胞大量积累鼠李糖，而半乳糖在胞内只有少量增加，但二者在24 h下降。进入细胞生长期时，这两种糖的胞内浓度显著上升。与之不同，高温逆境下鲁氏接合酵母胞内存在葡萄糖、海藻糖、木糖醇和甘油。传统上的抗逆保护剂（海藻糖和甘油）在鲁氏接合酵母胞内只有极少量的积累，最大含量分别为（369.00±21.01）µg/g和（268.10±21.18）µg/g（8 h），而木糖醇水平却显著上升（（1 788.20±100.56）µg/g，8 h）。这表明对鲁氏接合酵母2013310而言，木糖醇，而非海藻糖和甘油，是其高温压力下的抗逆保护剂。然而，本研究结果表明，高盐压力下的鲁氏接合酵母细胞内没有葡萄糖。这可能是两个因素导致的：其一，高盐下的鲁氏接合酵母对外源葡萄糖的转运能力不强，导致胞内葡萄糖浓度处于检测线之下；其二，对高盐环境下的鲁氏接合酵母而言，葡萄糖可能并不是最适碳源，胞内葡萄糖被快速转化成其他糖类物质。全合成培养基中添加木糖醇、海藻糖、甘油对鲁氏接合酵母在高盐环境下的生长均有促进作用，相比空白对照，OD600nm分别提高了115.4%、217.0%、223.9%（数据未显示）。
结论
温度压力和盐压力是鲁氏接合酵母在酱油高盐固态发酵过程中遭遇的主要逆境。与其他环境压力不同，微生物对这两种逆境无法通过采用降解压力因子的方式缓解。本研究基于低营养全合成培养基，在营养、代谢和转录3个层面分析了鲁氏接合酵母2013310从生长适应期到对数生长初期的高盐和高温逆境响应。总体而言，该酵母采用了不同的策略来适应高温和高盐逆境。遭遇高盐压力的鲁氏接合酵母细胞更需要外源氨基酸，而补充维生素和氨基酸有助于缓解酵母细胞的高温压力。谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸和乙酸代谢对酵母细胞适应高温和高盐逆境极其重要。本研究加深了对耐盐鲁氏接合酵母耐温机制的理解。同时，微生物不同抗性之间存在交互作用。鲁氏接合酵母耐高盐的特性与对温度的高敏感性之间的关联性有待研究，这将有助于为双抗逆新型鲁氏接合酵母细胞株的构建提供方向和着力点。
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