拮抗菌生长曲线测定、鉴定及对烟草赤星病室内防治效果（一）
由链格孢菌（Alternaria alternata）引起的烟草赤星病主要危害成熟期的烤烟上部叶，发病严重地块几乎绝收，严重影响烟叶产质量。目前化学防治依然是防治烟草赤星病的主要措施，然而长期使用化学药剂易造成环境污染、农药残留和危害人畜健康等问题，且近年来有研究报道链格孢菌对96%（质量分数）苯醚甲环唑和97%（质量分数）氟环唑及93%（质量分数）菌核净等药剂已产生抗药性。而生物防治具有无毒、无残留和对环境友好等优点，成为植物病害防治研究的热点之一。
目前，植物病害生物防治中应用最广泛的为芽胞杆菌属细菌，因其有抗菌谱广、耐盐性强、能产生多种拮抗作用酶、繁殖快、抗逆性强和生物安全性高等优点，具有较高应用价值。宋莉莎等从贵州省瓮安县烟区土壤中筛选具有拮抗作用的细菌发现，甲基营养型芽胞杆菌（Bacillus methylotrophicus）对链格孢菌有较强的抑制作用，其无菌发酵液对该病菌抑菌带可达23.5 mm。从福建、山东和云南等地烟草叶片中分离得到187株菌株，发现萎缩芽胞杆菌（Bacillus atrophaeus）与贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）分泌的脂肽类物质对链格孢菌菌丝生长也有明显抑制作用，抑制率分别为56.9%和65.0%。
前期调查发现，贵州省清镇市卫城镇烟区烟草赤星病发生严重，部分地块发病率高达100%，几乎绝收，给当地烟农造成巨大经济损失。为筛选对该地区烟草赤星病具有拮抗作用的菌株，采用5点取样法，从贵州省清镇市卫城镇烟草赤星病发生严重地块采集健康烟株根际土壤，带回实验室进行芽胞杆菌分离纯化，使用平板对峙法筛选对病原真菌具有较好拮抗作用的菌株，根据形态特征、生理生化指标及构建系统发育树对其进行鉴定，并通过盆栽试验测定该拮抗菌L249对烟草赤星病防治效果，旨在为烟草赤星病的生物防治提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
供试土样采集于贵州省清镇市卫城镇烟草赤星病发生严重地块健康烤烟根际，采用5点取样法取样后用无菌自封袋封存并编号。供试病原菌为链格孢菌（Alternaria alternata）、高粱叶点霉菌（Phyllosticta sorghina）、大斑突脐蠕孢菌（Exserohilum turcicum）、烟草炭疽菌（Colletotrichum nicotianae）和尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporum），均由贵州大学烟草学院病理实验室保存并提供。供试烤烟品种为K326，选用长53 mm、宽35 mm、高58 mm规格的育苗盆育苗，每盆1株，待烤烟幼苗生长至5片真叶时，移栽至底径为140 mm、口径180 mm、高160 mm花盆中继续生长至8~10片叶备用。
供试药剂为10%苯醚甲环唑水分散粒剂（WDG）（先正达南通作物保护有限公司），供试试剂有1%（质量分数）草酸铵结晶紫、明胶及9%（质量分数）NaCl溶液等。
1.2方法
1.2.1土壤拮抗菌分离
采用稀释涂布平板法，称取10 g土样放入含90 mL无菌水的锥形瓶中，置于37℃、200 r/min恒温摇床振荡20 min。85℃水浴处理10 min后梯度稀释得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的土壤悬浮液。取100μL稀释液均匀涂布于LB平板，各浓度3个重复，于37℃恒温培养箱中过夜培养。待平板长出单菌落后，挑取形态不同的单菌落纯化后编号，置于LB液体培养基中37℃振荡培养24 h后，与30%（体积分数）甘油等比例混合后置于冻存管中，-80℃保存备用。
1.2.2拮抗菌抑菌谱测定
将5种植物病原真菌在PDA培养基上培养7 d后，分别取直径为6 mm的菌饼接种到PDA平板中央（培养皿直径为85 mm），距中央2.5 cm处再接种5μL拮抗菌菌液，以只接种病原菌的PDA平板为对照，每种病原菌接种4个培养皿，重复3次（下同）。待对照长满培养皿后，测量抑菌带宽度并挑取链格孢菌边缘菌丝，置于Axio Imager M2蔡司金相显微镜（德国Carl Zeiss Microscopy GmbH公司）下观察菌丝形态。采用十字交叉法测量菌落直径，并计算菌丝生长抑制率。
生长抑制率=（对照菌落直径-处理菌落直径）*100%
1.2.3拮抗菌生长曲线测定
将保存的拮抗菌活化后挑取单菌落接种到装有5 mL LB培养液的试管中，置于37℃、200 r/min条件下的摇床中培养12 h后，获得种子液。使用移液枪吸取1 mL种子液接种于100 mL的LB培养液中进行培养，采用比浊法，每隔30 min用分光光度计在600 nm波长处测定菌液的吸光度值（OD），直至OD值缓慢下降时停止测量。
1.2.4生物膜测定
将活化的芽胞杆菌接种于LB培养基中，37℃、200 r/min培养至OD600约为1.0时，4℃离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬于等体积的MSgg培养基中。取5 mL MSgg培养基加入12孔细胞培养板中，然后分别滴加10μL菌悬液，于37℃静置培养24 h后观察成膜情况。
1.2.5拮抗菌生防相关酶类测定
将筛选出具有良好拮抗作用的菌株接种于LB液体培养基中，置于37℃、200 r/min的摇床中过夜培养后，滴加5μL菌液至蛋白酶检测培养基和纤维素酶检测培养基中央，37℃培养箱中培养24 h后观察菌落周围是否产生消解圈。
1.2.6拮抗菌鉴定
结合形态特征、生理生化指标及构建系统发育树分析方法对筛选的拮抗菌进行鉴定。
（1）菌落形态观察：将活化后的菌株接种于LB液体培养基中过夜培养，取5μL菌液接种于LB平板中央并置于37℃培养箱中过夜培养，24 h后观察菌落形态特征。
（2）生理生化指标：参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对拮抗细菌进行革兰氏染色、酶的水解、明胶的液化、柠檬酸钠盐的利用、吲哚试验、V-P试验、甲基红试验及耐盐试验等多项生理生化特征分析。
（3）16S rDNA、gyrA序列扩增及系统发育分析：使用BioTeke细菌基因组DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司），提取拮抗菌株DNA。利用细菌通用引物16S rDNA及gyrA对提取的细菌DNA进行PCR扩增后，采用1.0%（质量分数）琼脂糖凝胶进行电泳检测，PCR扩增产物送生工生物工程（北京）股份有限公司测序。测序结果修正后经NCBI进行BLAST初步比对，根据比对结果下载亲缘关系较近的序列及模式菌株（表1），在BioEdit 7.0软件上对各菌株的序列进行修正后，以黄热厌氧芽胞杆菌（Anoxybacillus flavithermus）为外群，使用MEGA 5.0软件并采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）构建多基因系统发育树。
表1用于构建系统发育树的菌株号及GenBank登录号①
1.2.7拮抗菌防治烟草赤星病盆栽试验
待烤烟生长至8~10片叶时进行处理，采用喷雾法将浓度为1×108 cfu/mL的拮抗菌发酵液均匀喷施在烟草叶片正面，以液滴不滴落为标准，晾干后在叶片上接种在PDA培养基上培养7 d、直径为6 mm的链格孢菌菌饼，每片烟叶接种4个菌饼。试验设4个处理：以喷施无菌水的烟株为CK1；喷施无菌水晾干后接种病原菌的烟株为CK2；喷施发酵液晾干后接种病原菌的烟株为处理3；喷施2 000倍液10%苯醚甲环唑WDG晾干后接种病原菌的烟株为处理4。每处理3个重复，每个重复10株烟苗。置于光照和黑暗各12 h、温度为28℃、相对湿度为90%以上的温室中培养，直至CK2出现明显病斑时，根据赤星病病害分级标准进行病害调查（以叶片为单位），并计算发病率、病情指数和相对防效。
计算公式：
1.3数据分析
使用Excel 2010软件对数据进行统计处理，运用DPS数据处理系统Duncan’s新复极差法对试验数据进行差异显著性检验。
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