中药单体组合物绿原酸、黄芩苷、厚朴酚对大肠杆菌生长曲线的影响
摘要：旨在研究由不同单体组成的中药单体组合物对多重耐药大肠杆菌的抑菌作用。通过最小抑菌浓度（MIC）、分级抑菌指数（FICI）、中药单体组合物的筛选、中药单体组合物的剂量配比优化等试验，获得一种由绿原酸、黄芩苷、厚朴酚按照质量比为2∶4∶1的中药单体组合物。通过测定中药单体组合物对多重耐药大肠杆菌的生长曲线、相对电导率、核酸和蛋白渗漏、胞外碱性磷酸酶（AKP）含量、胞内DNA含量变化的影响，初步探究中药单体组合物对多重耐药大肠杆菌的体外抑菌作用。结果显示：绿原酸、黄芩苷、厚朴酚、硫酸小檗碱对多重耐药大肠杆菌的MIC分别为6.25、6.25、6.25和1.25 mg/mL,不同组分之间存在协同或相加作用，其中绿原酸和厚朴酚联用的FICI为0.5.中药单体组合物可以抑制细菌的生长，破坏大肠杆菌细胞的完整性，引起细胞内容物渗漏使菌液的电导率显著升高（P<0.05），菌液OD260 nm、OD280 nm值显著升高（P<0.05），AKP含量显著升高（P<0.05），DNA含量变化明显。本研究表明中药单体组合物主要通过破坏多重耐药大肠杆菌的细胞膜、细胞壁的结构完整性从而实现抑菌作用，为中药复方治疗或预防细菌性疾病的药物筛选和研发奠定基础。
大肠杆菌病是威胁畜禽养殖的头号细菌病，是由大肠杆菌感染引起的一种多发的传染性疾病。随着我国养殖业集约化程度不断提高，畜禽大肠杆菌病在各地的流行趋于严重。畜禽患病后引起急性败血症或多组织器官炎症从而影响畜禽繁殖机能，甚至可能导致畜禽死亡，对畜禽养殖户造成极大的经济损失。目前对禽大肠杆菌病主要是采用抗生素治疗，但是随着耐药菌株的不断出现，耐药谱的不断增加，给禽大肠杆菌病的防治带来了重重困难。在国家“减抗”、“替抗”政策的推动下，在大肠杆菌疫苗效果不理想、耐药菌株不断出现的情况下，中草药因其来源广泛、药理作用多样且不易产生耐药性等优点吸引了研究者的广泛关注，其在畜禽养殖业具有广阔的应用前景。中草药及其提取物对细菌、真菌都有较好的抗菌效果。然而单味中药效果单一，而复方中药因存在多个有效部位，具有多层次的复合效果，因此开发替代抗生素的低毒或无毒副作用、安全高效的抗微生物复方中药是当今研究的热点。根据中兽医辨证论治原则，鸡大肠杆菌病可辨为湿热证，应选择清热燥湿，凉血止痢的中药。黄芩、黄连性味苦、寒，有清热燥湿、泻火解毒之功效；金银花性味甘、寒，有清热解毒、疏散风热之功效；厚朴性味苦、辛、温，有行气燥湿，逆降平喘之功效。诸药合用，共奏清热解毒、化湿和中理气之功效。黄芩苷、小檗碱、厚朴酚、绿原酸分别为我国传统中药黄芩、黄连、厚朴、金银花中的主要有效活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等多重功效。
本试验结合实验室前期研究基础，通过体外筛选敏感中药单体以及结合正交试验优化出中药单体组合物最优配比。探讨中药单体组合物对禽致病性大肠杆菌的抑菌作用，为今后禽大肠杆菌病的防控提供理论依据，为解决禽致病性大肠杆菌日趋严重的耐药性问题提供一种新的治疗策略，为治疗或预防细菌性疾病的中药复方药物筛选和研发奠定基础。
细菌生长曲线的测定
将细菌划线接种在LB固体培养基上，37℃恒温培养箱过夜培养。挑取固体培养基上长势良好的单一菌落接种于LB营养肉汤中，于37℃、220r/min的条件下恒温摇床培养过夜孵育。将过夜培养的细菌悬液按照1∶100的比例接种于无菌的LB营养肉汤（稀释至106CFU/mL），然后在菌悬液中分别加入不同药物配制相应的浓度，每种组合设置3个重复。相同体积的单独加入药物无菌LB营养肉汤作为对照，混合液放入恒温振荡器（37℃、220r/min）中培养。通过检测评价不同药物对大肠杆菌的生长情况，0——18h,每隔1h测定菌液在600nm波长处的吸光值，单独加入药物的营养肉汤用于空白调零。试验进行3次重复。
中药单体组合物绿原酸——黄芩苷——厚朴酚对大肠杆菌生长曲线的影响
如图1可知，未经处理的多重耐药大肠杆菌的生长曲线呈典型的“S”型，大约在培养6——8h左右到达对数生长期，细菌在14h之后数量趋于平稳。与空白组相比，在培养的初始阶段添加不同浓度的中药单体组合物后，细菌的生长受到抑制。在同一培养时间下，3种浓度中药单体组合物处理后的菌液的OD值均低于空白对照组，且菌体进入对数生长期的时间滞后，当添加1/2MIC、1MIC的中药单体组合物后，细菌的生长被抑制，平稳期的数量降低。而2MIC浓度中药单体组合物与细菌作用后，细菌的生长被完全抑制，培养周期内OD值基本没有变化，说明本研究筛选到的中药单体组合物对大肠杆菌生长情况有抑制作用。
图1中药单体组合物绿原酸——黄芩苷——厚朴酚对大肠杆菌E——32生长曲线的影响
中药可从通过影响细菌生长、干扰细胞壁合成、损伤胞浆膜、影响细胞蛋白合成、影响核酸合成等多方面表现抗菌作用。通过测定黄连配方颗粒、标准汤剂及盐酸小檗碱对大肠杆菌生长曲线等试验的影响，研究了其对大肠杆菌的抑菌机理。本试验筛选出最优中药单体组合物绿原酸——黄芩苷——厚朴酚并探究了其对多重耐药大肠杆菌生长情况的影响，发现中药单体组合物对细菌的抑制作用与时间和浓度有关，1/2MIC和1MIC处理组的抑菌效果随着时间的延长逐渐减弱，而2MIC组在0——18h的抑菌曲线保持不变，说明浓度为2MIC时可以完全抑制大肠杆菌的生长。这些结果表明，绿原酸、黄芩苷和厚朴酚组成的中药单体组合物具有很好的抗菌能力。