利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（一）
高通量测序（high-throughput sequencing，HTS）能直接从样品中提取DNA，并同时对数百万个基因样本进行测序分析，有效地避免了传统微生物分离、培养的繁琐过程和可能造成的污染。HTS在检测不可培养微生物和低丰度微生物方面有其独到之处，为全面描述细菌群落动态、分析微生物代谢途径与腐败菌之间的相关性提供了可靠的方法。与传统的Sanger法测序相比，HTS耗时更短、精准度更高、且成本更为低廉。目前，HTS已应用于食品领域的许多研究中，如传统发酵鲅鱼、鸡肉、猪肉等。Cai Luyun等利用微波或远红外解冻红鲷鱼片并研究解冻技术对微生物多样性的影响，发现解冻方式对微生物优势菌群影响较小，贮藏前期假单胞菌属是其主要菌属，贮藏24 h以后，芽孢杆菌的比例显著增加，也成为红鲷鱼片的优势菌群。
芳樟醇是一些芳香植物精油，如薰衣草精油、芳樟精油的主要成分之一，常被作为芳香剂和调味剂添加到洗涤剂和食品中，每年全球总消费量超过1 000 t。芳樟醇还被美国食品和药品管理局归类为“公认安全”（generally recognized as safe，GRAS）物质，联合国粮食及农业组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会确定了芳樟醇的每日允许摄入量（acceptable daily intake，ADI）为0～0.5 mg/kgmb。芳樟醇除了简单的调香调味功能之外，还具有抗菌、抗炎症、抗肿瘤、抗高血压、预防神经退行性疾病（阿尔茨海默病等）等功效。
莓实假单胞菌（Pseudomonas fragi）广泛存在于各种冷藏食品中，已有大量文献报道莓实假单胞菌是肉品、海产品和乳制品中的优势腐败菌，极易导致食品腐败变质，且随着时间的推移，莓实假单胞菌在食品菌相体系中的优势地位更加明显。鉴于前人对莓实假单胞菌的研究较少，且相关研究大多集中于畜禽肉类，水产品尤其是三文鱼中莓实假单胞菌的相关报道较少见，且鲜有探究芳樟醇对三文鱼源莓实假单胞菌的抑菌活性及机理的研究，因此，本实验应用HTS分析不同贮藏期三文鱼的菌相变化，再以提取自三文鱼中的莓实假单胞菌MS 02为靶细菌，研究芳樟醇对其抑菌性能及作用机制。
本研究利用细菌生长曲线表征芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌效果，通过扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）观察菌体的微观形态变化，通过测定细菌细胞膜的通透性、完整性、菌体内碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）和钠钾ATP酶活力来分析芳樟醇的抗菌机制，为芳樟醇作为天然抑菌剂对三文鱼保鲜提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
三文鱼购自辽宁省大连市麦德龙水产市场，原产地法罗群岛。
芳樟醇（纯度大于98%）上海源叶生物科技有限公司；TaqPCR Master Mix试剂盒上海生工生物工程有限公司；AKP测试盒、超微量ATP酶（Na＋K＋-ATP酶）测试盒南京建成生物工程研究所；二乙酸荧光素（fluorescein diacetate，FDA）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基、LB肉汤青岛海博生物科技有限公司；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.2、1×）、戊二醛北京索莱宝生物科技有限公司；氨苄青霉素国药集团化学试剂有限公司；甲醇天津福晨化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；LRH-250A生化培养箱上海一恒科技有限公司；Victor X3酶标仪美国Perkin Elmer公司；Legend Micro21R微量冷冻离心机美国赛默飞世尔科技公司；MS-105DU电子分析天平、LE703电导率仪瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；cs 150 gx3超速离心机、F7000荧光分光光度计日本日立公司；MLS-3030CH立式高压蒸汽灭菌锅日本三洋公司；THZ-D台式恒温振荡箱太仓市实验设备厂；SCIENTA-IID超声波细胞粉碎器宁波新芝生物科技公司。
1.3方法
1.3.1三文鱼样品的预处理和高通量测序
三文鱼捕捞后立即宰杀放血去内脏，经液氮速冻后空运至辽宁，取三文鱼腹部鱼肉，干冰冷冻保藏运输至本实验室。将三文鱼分割成若干个质量为10 g的鱼块（2 cmh2 cmh2 cm），放入无菌培养皿内，用3层保鲜膜密封，置于冰箱内于4℃下保存，分别于第0、3、6、9、12天取样，样品取出后立刻放入－80℃冰箱中保存，取样结束后将样品送至天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行HTS分析，样品在干冰环境中贮运。样品经过DNA提取、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增及纯化、系统数据库的建立及测序后，得到原始数据，处理后得到有效数据，基于有效数据进行可操作单元（operational taxonomic units，OTUs）聚类和物种分类分析。
1.3.2三文鱼优势腐败菌的分离、纯化及鉴定
选取4℃贮藏12 d的腐败三文鱼块进行微生物菌群结构鉴定。将10 g鱼肉倒入无菌蒸煮袋中，加入90 mL无菌生理盐水，匀速拍打2 min制成菌悬液，10倍梯度稀释后取1 mL稀释液涂布于PCA培养基表面，每个稀释梯度设置3个平行。选取菌落总数为30～300的平板，观察菌落特征后，挑取平板上大小、形态、隆起程度、光泽度及颜色等不同的菌落接种于LB肉汤中，28℃振荡培养12 h，然后在PCA培养基上划线，于28℃培养24 h，重复2～3次，再挑取单菌落接种于LB肉汤中，28℃培养12 h，以10%（体积分数）接种量传代培养12 h至对数生长期，最后将对数生长期菌液与等体积的50%（体积分数）甘油水溶液混匀，置于－80℃冰箱中冻存保藏菌种。
将－80℃下保藏的菌种按照10%（体积分数）的接种量加入LB肉汤中，28℃培养24 h进行活化，传代培养两次后，取1 mL对数生长期菌液（107CFU/mL）到1.5 mL离心管中，在室温下6 000 r/min离心5 min，收集菌体，用100µL无菌水重悬，再使用PCR仪提取细菌DNA（94℃、40 min），随后在室温下以6 000 r/min离心5 min，收集上清液在－20℃下保存。制备PCR扩增体系扩增细菌DNA，50µL体系组分为：1μL DNA样品；2μL上、下游引物（10μmol/L）；25μLTaqPCR Master Mix（2×）和20µL无菌水。PCR程序：94℃、5 min；94℃、40 s，54℃、40 s，72℃、1 min，30个循环；72℃、5 min；4℃至反应完成。
将PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司检测基因序列。将测序得到的基因序列与NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已知微生物基因序列进行BLAST比对分析，采用MEGA 5分析16S rRNA结果，采用Neighor-Joining法构建系统发育树。
1.3.3芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌性测定
1.3.3.1芳樟醇最小抑菌浓度的测定
采用96孔板稀释法测定芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的最小抑菌质量浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。将适量芳樟醇溶解于50%（体积分数，下同）甲醇溶液，配制质量浓度为8.00μg/mL的芳樟醇母液，采用二倍梯度稀释法用50%甲醇溶液稀释制得质量浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50μg/mL的芳樟醇溶液备用。按照100μL/孔向96孔细胞培养板中加入活化两次后处于对数生长期的菌液（107CFU/mL），再分别按照100μL/孔加入不同质量浓度的芳樟醇溶液（终质量浓度分别为4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μg/mL），分别以等体积的50μg/mL氨苄青霉素、50%甲醇溶液作为阳性对照和空白对照，每组3个平行。将96孔板置于28℃细菌培养箱培养12 h，再用酶标仪于595 nm波长处测定光密度值OD595 nm，选择OD595nm低于阳性对照组的最低质量浓度作为芳樟醇对莓实假单胞菌的MIC。
1.3.3.2莓实假单胞菌MS 02生长曲线的测定
采用抑菌曲线法评价芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果。取－80℃下保藏的莓实假单胞菌MS 02菌种，参考1.3.2节方法进行活化，传代培养两次后吸取500μL对数生长期的菌悬液（107CFU/mL）加入到25 mL LB肉汤当中，充分振荡均匀后再分别按照终质量浓度MIC、2 MIC加入芳樟醇溶液，以等体积50%甲醇溶液作空白对照，在28℃、160 r/min的摇床中培养24 h，每隔2 h取样，使用酶标仪测定菌液595 nm处的光密度值OD595 nm。
1.3.3.3莓实假单胞菌MS 02形态观察
采用SEM观察莓实假单胞菌MS 02细胞形态变化。取－80℃下保藏的莓实假单胞菌MS 02菌种，参考1.3.2节方法进行活化，传代培养两次后向对数生长期的菌悬液（107CFU/mL）中加入芳樟醇，使菌悬液中芳樟醇的终质量浓度为MIC和2 MIC，以等体积50%甲醇溶液为空白对照。在28℃、160 r/min的摇床中培养6 h后，6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌体。以5 mmh5 mm的铝片作承载物，将菌体置于质量分数2.5%的戊二醛溶液中固定4 h，再用无菌PBS洗涤3次，随后依次以体积分数30%、50%、70%、90%乙醇溶液和无水乙醇进行梯度洗脱，每级静置15 min，将试样室温放置12 h使其完全干燥后喷金观察细胞形态。
1.3.3.4电导率的测定
取活化两次培养至对数生长期的莓实假单胞菌液，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用PBS洗涤3次后制得重悬菌液（107CFU/mL），分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇溶液，以等体积50%甲醇为空白对照。于摇床中培养6 h，每小时取样测电导率。
1.3.3.5细胞膜通透性测定
通过FDA染色实验研究芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02细胞膜通透性的影响。将活化两次培养至对数生长期的菌液6 000 r/min、4℃离心15 min，收集菌体并重悬于PBS中，调整菌悬液浓度为107CFU/mL，再分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照。摇床培养12 h，取各组菌悬液于6 000 r/min、4℃离心10 min收集菌体，用PBS洗涤2次后收集菌体，加入250μL FDA-丙酮溶液（2 mg/mL）。常温下放置20 min后用PBS洗涤3次，8 000 r/min、4℃离心10 min，收集菌体并重悬于PBS中，用荧光分光光度计在激发波长为297 nm、发射波长为527 nm条件下测定样品的FDA荧光强度，以表征细胞膜通透性。
1.3.3.6细胞膜完整性测定
按1.3.3.5节的方法制备重悬液（107CFU/mL）并分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照，分别在28℃、160 r/min摇床中培养6 h，每3 h取1 mL的菌悬液，以6 000 r/min，4℃离心10 min，上清液过0.22μm滤膜过滤。取200μL滤液于96孔板中，使用酶标仪于260 nm波长处测定其光密度值OD260 nm，每次实验3个平行。
1.3.3.7胞内酶活力测定
将活化两次培养至对数生长期的菌液以6 000 r/min、4℃离心15 min，收集菌体并重悬于PBS中，调整菌悬液浓度为107CFU/mL，再分别加入终质量浓度为MIC和2 MIC的芳樟醇，以等体积50%甲醇为空白对照。摇床中培养6 h，离心收集菌体，加入PBS重悬，冰水浴超声破碎菌体，每次超声时间为5 s，间隔10 s，重复4次。参照AKP试剂盒说明书方法，测定AKP活力。参照超微量ATP酶试剂盒说明书测定钠钾ATP酶活力。
1.4数据处理与统计分析
实验设置3个平行，实验结果用平均值±标准差表示。采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，采用Tukey检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。采用Origin 8.5软件作图。
利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（一）
利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（二）
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