综述微生物修复菲污染中降解菌的菌属、降解机理、分子机制、影响因素（三）
3、分子水平的研究
微生物降解作为去除土壤PAHs的主要方式，对其研究重点不再停留于单一寻找降解菌属，而是深入探究其遗传调控机制的同时构建高效工程菌。随着研究范围的不断扩大，对分子水平上的认识也在不断完善，如降解酶簇种类、编码基因及基因坐落位置和关键基因的克隆等方面。
3.1降解酶簇种类
微生物降解菲是通过细胞内一些酶促反应实现的。细菌利用双加氧酶而真菌依赖单加氧酶。这些降解酶都存在两个特性：一是降解酶的表达依赖降解物的诱导；二是降解酶的底物专一性差。如恶臭假单胞菌(PseudomonasputidaOUS82)，同一种双加氧酶可以同时氧化菲、萘，而且此酶经过萘的诱导后又可以将多种芳香烃氧化成酚性物质如蒽、联苯、硫芴、苯并苊等。以细菌为例，降解菲的过程主要涉及两种关键酶，分别是羟基化双加氧酶和邻苯二酚双加氧酶。
3.1.1羟基化双加氧酶羟基化双加氧酶(ring-hydroxylating dioxygenase,RHO)是细菌在降解菲代谢过程中的关键酶之一。由末端氧化酶(terminal oxygenase)和铁氧还蛋白(ferredoxin)，以及铁氧还蛋白还原酶(ferredoxin reductase)三部分功能蛋白组成的依赖NAD(P)H的酶系统。其中末端氧化酶是由ɑ亚基(含有铁硫中心和单核铁原子结构域)和β亚基构成的六聚体结构，具有催化和识别底物的作用，铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶负责加氧过程中电子的传递。羟基化双加氧酶可以催化分子氧完成对芳香环的攻击形成羟基化产物。在加氧的过程中，末端氧化酶、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶组成了一条电子传递链，铁氧还蛋白还原酶将来自NADH的两个电子传给铁氧还蛋白，由铁氧还蛋白传递给具有催化和识别功能的末端氧化酶来处理。
3.1.2邻苯二酚双加氧酶邻苯二酚双加氧酶可以催化羟基化的底物使菲彻底开环，是降解代谢途径另一个关键酶。包括邻苯二酚1,2-双加氧酶、邻苯二酚2,3-双加氧酶。前者属于内二元醇双加氧酶，可以催化邻苯二酚转化为顺,顺-粘糠酸，断裂发生在两个羟基之间；后者属于外二元醇双加氧酶，催化邻苯二酚转化为2-羟基己二烯半醛，断裂发生在某个羟基一侧并且需要Fe2+的协助，由于C23O的活性依赖Fe2+，在反应过程中部分Fe2+会被氧化成Fe从而使C23O的活性受到了影响，因此C23O催化的开环反应是芳香化合物降解的限速步骤。在假单胞菌属中C12O和C23O同时存在。
3.2降解基因
3.2.1降解基因的种类目前能降解多环芳烃菲的基因家族包括phd、phn、nid、nag等。其中研究最多的是phd、phn基因家族。phd基因在从毛单胞菌中的基因序列为phdAbAaBAcA dDE，其中phdAb基因编码铁氧化还原蛋白，phdAa基因编码铁氧化还原蛋白还原酶，phdB基因编码顺式-二羟基脱氢酶，phdAc和phdAd基因分别编码铁硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亚基，phdD基因编码异构酶，phdE基因编码水合酶-醛缩酶。phn基因由9个开放阅读框(ORFs)组成，顺序为phnRSFECDAcAdB，其中phnR、S是调控基因，phnF基因编码乙醛脱氢酶，phnE基因编码水合酶-醛缩酶，phnC基因编码外源型双加氧酶，phnD基因编码异构酶，phnAc基因和phnAd基因分别编码起始双加氧酶铁硫蛋白(ISP)的大(α)、小(β)亚基，phnB基因编码二羟基脱氢酶。
3.2.2降解基因的位置phn、phd、nid和nag基因家族等存在位置的多样性，可能位于染色体上，或是存在于质粒中，也可能两者兼有。当功能基因底物越复杂、降解对象含有的芳香环数量越多，其所在的操纵元就会越大，这时一般小质粒不能承载，通常由染色体或两者共同负担。表3为不同降解基因编码的蛋白及存在的位置。
3.3功能基因的研究
有关菲降解基因的研究已取得长足的进步，很多实验室从不同菌种中克隆得到了部分降解菲的基因片段并进行了功能验证。Pinyakong等在Sphingomonassp.P2的两个酶切片段上得到铁硫蛋白的大小亚基基因及编码铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶基因。Kiyohara等在Pseudomonas82的染色体DNA上得到pahAa、b、c、d及pahB、C、D、E、F的基因片段。Saito等在Pseudomonasputida中成功克隆了Nah基因。赵和平从PseudomonasputidaNCIB9816-4中克隆了nahAa、nahAb、nahAc、nahAd四个基因，分别编码该双加氧酶的三个组分Nap还原酶、Nap铁氧还蛋白、铁硫蛋白大小亚基。
表3不同降解基因编码的蛋白及存在的位置
相关新闻推荐
1、冷鲜猪肉中热杀索丝菌生长动力学模型和货架期预测模型构建——摘要、材料与方法
2、不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——摘要、结论与讨论