PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中对其生长状态、溶血酶活性及神经磷脂酶活性影响（一）
炭疽芽胞杆菌()、蜡样芽胞杆菌()和苏云金芽胞杆菌()均属于蜡样芽胞杆菌群，在遗传学上有很高的相似性。PlcR(Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子，但基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短PlcR蛋白。为了研究基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响，文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板，构建重组表达质粒pBE2A-后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株，对其进行表型分析。结果显示，炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复，但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性，表明将蜡样芽胞杆菌的基因导入炭疽芽胞杆菌后，可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。
PlcR是广泛存在于蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中十分重要的多功能调控因子，它可激活多种编码毒力因子的基因表达，如神经鞘磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。在蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中，PlcR蛋白受PapR的激活，PapR在的控制下以前肽形式表达后通过SecA分泌机制输出到细胞外，在胞外成为激活的五肽形式后，再通过寡肽透性酶系统Opp进入细胞，与PlcR结合并激活PlcR，从而与PlcRbox结合，进而调控染色体上的几十个基因。改变基因的序列可使蜡样芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌中的溶血素和细胞毒素的表达与活性减弱。在蜡样芽胞杆菌PlcR缺失株中，一些蛋白质如：神经鞘磷脂酶、溶血素、肠毒素及许多蛋白酶是不表达的。炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌属于蜡样芽胞杆菌群，炭疽芽胞杆菌中存在与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌同源的基因序列，但在炭疽芽胞杆菌当中基因发生了一个无义突变，导致其提前终止，故无法发挥其正常的功能。本文将蜡样芽胞杆菌的基因导入炭疽芽胞杆菌减毒疫苗株A16R(pXO1+pXO2-)中并对其生长状态、溶血酶活性及神经磷脂酶活性进行研究。
1材料和方法
1.1菌株及质粒
本实验中用到的菌株及质粒见表1。
1.2方法
1.2.1 PlcR在A16R中的表达
1.2.1.1表达载体pBE2A-构建以CMCC63301基因组为模板，用引物_F/R(表2)扩增编码区片段，用HⅠ和Ⅰ酶切后连接到本实验室保存的载体pBE2A上，构建重组表达质粒pBE2A-，在该重组质粒中，基因处于枯草芽胞杆菌淀粉酶基因启动子的下游并受其调控。将构建好的重组表达质粒pBE2A-转化到DH5α中，测序正确后，转入大肠杆菌SCS110中去甲基化，后提质粒电击转化到炭疽芽胞杆菌中疫苗株A16R中构建pBE2A-/A16R，同时把表达载体pBE2A也导入A16R中，构建pBE2A/A16R的用作对照。
1.2.1.2 PlcR表达、纯化及抗PlcR多克隆抗体制备为了将来检测基因是否在炭疽芽胞杆菌中中表达，我们制备了抗PlcR多克隆抗体，具体方法是：以CMCC63301基因组为模板，用引物pET_F/R(表2)扩增片段，用HⅠ和dⅢ酶切连接到pET32a载体上，将构建好的质粒化学转化到DH5α中，测序正确后，转化到BL21感受态中，构建pET32a-/BL21，同时用相同的方法构建pET32a/BL21。
注：下划线部分表示限制性酶切位点。
pET32a-/BL21诱导表达判断蛋白的可溶性，用可溶性蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。获得纯化好的蛋白后采用背点注射和腹腔注射免疫小鼠。一周后鼠尾取血ELISA测效价，效价比较高时开始眼球取全血，制备鼠多克隆抗体血清。
1.2.1.3 Western blot分析确认PlcR在炭疽芽胞杆菌中表达将构建的重组菌株pBE2A-/A16R和pBE2A/A16R培养13 h，各收集1 mL培养菌液，离心弃上清，菌体用200μL纯水重悬，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10 min，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白转印至PVDF膜上，用上述制备的PlcR小鼠多抗进行免疫印迹分析，使用低温凝胶成像仪照相。
1.2.2表型分析
1.2.2.1生长曲线测定
在LB琼脂平板上挑取A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单克隆，转接到含5 mL LB液体培养基试管中，在摇床中37℃、220 r/min培养12 h，吸取50μL转接至新鲜5 mL LB试管中同样条件下培养12 h。吸取1 mL的菌液，转接于含100 mL LB的500 mL三角瓶中培养(37℃，220 r/min)。每隔1 h取出三角瓶，测定600并记录，绘制成生长曲线。
1.2.2.2溶血现象观察
在平板上挑取蜡样芽胞杆菌CMCC63301、炭疽芽胞杆菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单克隆，接到5 mL LB液体培养基试管中，37℃、220 r/min培养13 h，将已灭菌的滤纸片贴到绵羊血平板后，吸取5μL菌液滴到滤纸片中间待菌液晾干后放置37℃恒温培养箱中培养过夜，观察是否有溶血环及溶血环大小。
1.2.2.3神经鞘磷脂酶活性观察
在平板上挑取蜡样芽胞杆菌CMCC63301、炭疽芽胞杆菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单克隆，接种到5 mL LB液体培养基试管中，37℃、220 r/min培养菌株13 h，各吸取5μL菌液滴加到配制好的卵磷脂琼脂培养基(LB培养基+50%葡萄糖水溶液+50%卵黄盐水悬液)中待菌液晾干后放置37℃恒温培养箱中培养过夜，观察是否有乳白色神经鞘磷脂酶消化环及消化环大小。
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