空肠弯曲菌噬菌体生物学特性测定及生长曲线绘制（二）
1.5.5噬菌体对宿主菌生长的抑制作用
分别将1 mL对数期的空肠弯曲菌液(1.0×107CFU/mL)与1 mL稀释不同浓度的噬菌体液，分别按照感染复数为0.01，0.10，1.00的比例混合接种至20 mL MH肉汤。对照组为1 mL不含噬菌体的样品。在42℃微需氧摇床120 r/min培养24 h，每隔6 h测量混合物的OD600值。每次做3组平行。
1.5.6噬菌体裂解谱测定
噬菌体的裂解谱测定采用点斑法。取100μL宿主菌液，包括空肠弯曲菌2206，空肠弯曲菌CICC 22936，沙门氏菌14028，铜绿假单胞菌PA01，铜绿假单胞菌PA14，枯草芽孢杆菌WB800于5 mL半固培养基中，混匀后倒置于平板中。取5μL噬菌体液点滴到含有不同菌液的双层平板上。过夜培养观察有无噬菌斑。
1.6噬菌体基因组测序与分析
用病毒基因组DNA提取试剂盒提取噬菌体vB_Cj_QDYZ的DNA，送至上海凌恩生物公司进行测序。使用RAST软件对噬菌体进行基因预测，确定全基因组所有的开放阅读框(open reading frame，ORF)。根据BLASTp比对工具进行蛋白比对，推测每个ORF最相近的蛋白功能，即完成噬菌体的全基因组功能注释。
使用BLASTn对噬菌体vB_Cj_QDYZ的全基因组进行比对，并下载相似性较高的空肠弯曲菌噬菌体基因组，构建全基因组水平的进化树。使用BLASTp对噬菌体vB_Cj_QDYZ的主要衣壳蛋白序列、内溶素序列进行比对，利用MEGA 7.0软件，构建系统进化树。
1.7噬菌体在牛奶中的抑菌效果
将500μL浓度为1.0×106CFU/mL的空肠弯曲菌液与500μL噬菌体增殖液(1.0×108PFU/mL)混合于5 mL牛奶中，在42℃恒温培养箱中孵育。对照组为500μL无菌PBS缓冲液。分别于0 h和4 h取出样品，对其进行梯度稀释，在合适梯度吸取100μL涂布于哥伦比亚血平板上，42℃微需氧条件培养24～36 h，并计算哥伦比亚血平板上的空肠弯曲菌的单菌落总数。细菌数的计算如公式(1)所示:
细菌数/(CFU/mL)=菌落计数×10×稀释倍数(1)
2结果与分析
2.1空肠弯曲菌噬菌体的分离和纯化
通过双层平板法分离得到一株空肠弯曲菌的裂解性噬菌体。根据宿主菌及分离样品来源，将噬菌体命名为vB_Cj_QDYZ。经过6轮纯化，噬菌斑的大小和形态比较一致，如图1-A所示，它们的直径仅为1～2 mm，边缘光滑，没有任何晕环;噬菌斑清晰透亮，说明噬菌体的裂解能力较强。
A-噬菌斑形态;B-噬菌体的透射电镜形态
图1噬菌体vB_Cj_QDYZ的形态特征
2.2噬菌体透射电镜形态观察
如图1-B所示，噬菌体vB_Cj_QDYZ在透射电子显微镜下，有一个正二十面体的头部(直径约100.81 nm)和一条可伸缩的尾部(长度约65.90 nm)。根据ICTV第九次病毒类型研究报告，噬菌体vB_Cj_QDYZ属于有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科。目前大多数弯曲菌噬菌体都是肌尾噬菌体，具有终端泡和空头结构，有肌鞘并且可收缩。只有极少数弯曲菌噬菌体是长尾和短尾噬菌体。
2.3噬菌体的生物学性质
2.3.1噬菌体的热稳定性
如图2-A所示，噬菌体vB_Cj_QDYZ在30～60℃效价较稳定，且维持较高水平，大约为107PFU/mL。当噬菌体在70℃和80℃条件下孵育30 min，噬菌体效价明显降低至102PFU/mL;孵育60 min时，噬菌体完全失活。综上，噬菌体vB_Cj_QDYZ的温度耐受范围为30～60℃。
A-噬菌体的温度稳定性;B-噬菌体的pH稳定性;C-噬菌体的一步生长曲线;D-噬菌体对宿主的生长抑制作用
图2噬菌体vB_Cj_QDYZ的生物学特性
2.3.2噬菌体的pH稳定性
如图2-B所示，噬菌体vB_Cj_QDYZ在pH值为3～12时效价较稳定，基本维持在大约106PFU/mL。当噬菌体在pH=2的酸性环境或者pH=13的碱性环境孵育2 h后，完全失活。综上，噬菌体vB_Cj_QDYZ的pH值耐受范围是3～12。
2.3.3噬菌体的最佳感染复数
根据表1的数据，当感染复数为0.01时，噬菌体的效价达到最高，为2.07×108PFU/mL，因此vB_Cj_QDYZ的最佳感染复数为0.01。
表1噬菌体vB_Cj_QDYZ最佳感染复数
表2噬菌体vB_Cj_QDYZ的裂解谱
2.3.4噬菌体的一步生长曲线
噬菌体的一步生长曲线主要由潜伏期、裂解期和平稳期组成。如图2-C所示，噬菌体的潜伏期是60 min。从第60 min以后，噬菌体的效价突然大规模增加，呈现指数式增长，因此噬菌体的裂解期是150 min。在最后的60 min，噬菌体的效价不再出现明显改变，此阶段为平稳期。爆发量是由噬菌体的效价和宿主菌的数量决定的。在爆发末期，噬菌体的效价大约为4.5×108PFU/mL，而感染初期宿主菌的含量为1.0×107CFU/mL，因此爆发量为45 PFU/cell。
2.3.5噬菌体对宿主菌的生长抑制作用
由图2-D可知，噬菌体vB_Cj_QDYZ与空肠弯曲菌2206在不同感染复数混合培养后，初始OD600值基本相同，随着培养时间的延长，在微需氧条件培养第6 h时，对照组OD600值已达到0.145，加了不同浓度噬菌体组的OD600值是0.08。在培养第24 h，对照组OD600值为0.434，噬菌体组依然是0.08。表明噬菌体可在不同MOI下高效裂解宿主菌，噬菌体具有很强的裂解能力，可以有效抑制宿主菌的生长，具有良好的应用前景和抗菌潜力。
2.3.6噬菌体的裂解谱
空肠弯曲菌噬菌体vB_Cj_QDYZ可以裂解实验室的两株空肠弯曲菌，点斑法可以产生清晰透亮的噬菌斑。但是对于铜绿假单胞菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的平板，则没有清晰透亮的噬菌斑产生。充分说明空肠弯曲菌噬菌体vB_Cj_QDYZ具有很强的特异性。研究表明空肠弯曲菌噬菌体的裂解谱相窄，特异性强。
空肠弯曲菌噬菌体vB_Cj_QDYZ可以裂解实验室的两株空肠弯曲菌，点斑法可以产生清晰透亮的噬菌斑。但是对于铜绿假单胞菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的平板，则没有清晰透亮的噬菌斑产生。充分说明空肠弯曲菌噬菌体vB_Cj_QDYZ具有很强的特异性。研究表明空肠弯曲菌噬菌体的裂解谱相窄，特异性强。
2.4噬菌体vB_Cj_QDYZ全基因组分析
全基因组测序结果显示:噬菌体vB_Cj_QDYZ基因组为双链DNA，基因组全长为130 627 bp，G+C含量为26%。根据基因组大小在130～140 kbp，推断该噬菌体为Ⅲ组空肠弯曲菌噬菌体，属于CP8 virus。研究表明Ⅲ组噬菌体是目前分离最多、抑菌效果最好的空肠弯曲菌噬菌体。
在噬菌体全基因组中不含抗生素耐药基因、过敏原基因和毒力因子。进一步说明该噬菌体应用的安全性，具有良好的应用前景和抗菌潜力。噬菌体vB_Cj_QDYZ在NCBI上的序列号为OQ515481.1。
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