维氏气单胞菌分离与纯化、一步生长曲线、热稳定性及pH稳定性研究（一）
维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是一种人—兽—鱼共患的条件致病菌，该菌可感染草鱼、鲫、泥鳅、青虾、中华绒螯蟹、中华条颈龟、达氏鲟、虹鳟、大黄鱼等多种水生动物，引发的疾病发病快、死亡率高，对水产养殖业造成了巨大经济损失。研究人员发现，维氏气单胞菌对β-内酰胺类(氨苄西林钠、苯唑西林)、大环内酯类(硫氰酸红霉素、乙酰螺旋霉素)、喹诺酮类(恩诺沙星)、氨基糖苷类(硫酸新霉素、卡那霉素)、四环素类(四环素、强力霉素)、磺胺类(磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素类(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌药均产生了一定的耐药性，且极可能会随着抗菌药的继续滥用而在水生动物临床上更加快速且广泛地传播。同时，抗菌药的广谱性会破坏水体环境及养殖动物肠道中正常微生物群系的平衡，影响养殖鱼类的生长发育，进而造成水产养殖效率低下。因此，寻找安全、高效、环保的生物抑菌剂具有重要意义。噬菌体(Baceriophage)是一类能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋菌等微生物的病毒总称，它具有裂解宿主专一性强、研发时间短，不影响正常菌群，对人和动物安全，耐药风险低且无环境污染等优点，其在细菌病防控领域的应用研究呈逐年上升趋势。
目前，已报道用于水生动物细菌病防控的噬菌体研究数量有限，为了丰富水产致病菌的噬菌体库，筛选具有潜在应用价值的菌株，本试验以维氏气单胞菌为宿主菌，分离筛选烈性噬菌体，研究其生物学特性，旨在为进一步探索噬菌体防控技术提供科学依据。
1材料与方法
1.1菌株维氏气单胞菌(XJJYCA01)分离自发病鲫鱼，LB斜面保存于4℃。
1.2试剂与仪器试剂耗材：LB培养基、SM液、接种环、5 mL注射器、0.22μm过滤头、一次性培养皿等，均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。仪器：UV-2600紫外分光光度计、离心机(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒温水浴锅、Hitachi H-7650型电子显微镜、JJ-Y系列电子天平、生化培养箱等。
1.3噬菌体分离与纯化
参照双层平板法进行维氏气单胞菌的富集、筛选、纯化，略作修改。步骤如下：(1)无菌操作解剖，取发病鲫鱼肠道置于灭菌培养皿中，用生理盐水洗脱肠道内容物，4 000 r/min离心10 min后过0.22μm滤头备用；(2)挑取维氏气单胞菌(XJJYCA01)单菌落接种到含有5 mL LB液体培养基的试管中，28℃120 r/min摇床上过夜培养；翌日，将其转到含25～30 mL液体培养基的锥形瓶中，28℃120 r/min震荡培养3 h，使其达到对数期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病鱼肠道洗脱液，再28℃振荡培养48 h。之后将混合液以12 000 r/min离心10 min，小心吸取上清转移至另一无菌螺旋离心管后备用；(3)取100μL分离液与200μL对数期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷却至45℃的半固体培养基中，混匀立即倒入底层琼脂平板上，铺匀，28℃倒置培养24 h。翌日观察噬菌斑的生成情况；(4)用灭菌牙签挑取单个噬菌斑，接到5 mL液体培养基中富集10 min，然后向其中加入200μL宿主菌菌液，28℃培养2～3 h至液体澄清后，12 000 r/min离心取上清，即得到高效价的噬菌体。
1.4噬菌体效价的测定
采用噬斑法测定噬菌体效价。吸取100μL纯化的噬菌体液进行10倍稀释，将稀释的噬菌体液分别与200μL的XJJYCA01混合，利用双层平板法观察噬菌斑的个数。效价(PFU/mL)=噬菌斑数×10×稀释倍数。
1.5噬菌体的电镜观察
参照Ramíre-orozco等的方法，采用磷钨酸负染法，用Hitachi H-7650型电子显微镜进行电镜观察。
1.6噬菌体最适感染复数(MOI)测定
培养XJJYCA01至对数生长期(OD600≈0.5，约为1×108CFU/mL)，按照不同的感染复数(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液体培养基，28℃培养4 h。经培养后，9 000 r/min离心10 min，0.22μm过滤。收集上清，测定噬菌体效价，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。
1.7一步生长曲线
具体操作如下：将XJJYCA01培养至对数生长期。将噬菌体SJTJYCA01效价浓度稀释到1×108PFU/mL。1 mL噬菌体稀释液和10 mL宿主菌细菌悬液混合于锥形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培养液的锥形瓶P2中，混合均匀，再从锥形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液体培养基的P3中，混合均匀后在28℃及180 r/min条件下振荡培养。从0开始每隔一段时间取样。所取样品经9 000 r/min离心2 min，取上清液用双层平板法测定过滤液中噬菌体的效价。以取样时间为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线。裂解量=裂解期平均噬菌体数/潜伏期平均噬菌体数。
1.8热稳定性及pH稳定性
将噬菌体SJTJYCA01裂解液稀释至1×1010PFU/mL，分装到3个5 mL离心管中，每管各装3 mL。将离心管分别放置于40℃、60℃、80℃的恒温水浴锅中，每隔20 min测定各管中噬菌体的效价，直至测到60 min。以SM液为介质，用NaOH和HCl调节pH(3～11)。将噬菌体SJTJYCA01裂解液稀释至1×1010PFU/mL，取10μL加入到990μL不同pH的SM液中，28℃水浴2 h后测定各离心管中噬菌体的滴度。每个pH试验重复3次。
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