RW、WK、SF发酵菌株不同组合对紫秋葡萄酒品质、香气的影响（二）
1、材料与方法
1.1主要材料与试剂
紫秋葡萄：产自湖南怀化；皂土、白砂糖：市售；异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus，WK）、扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera，SF）：湖北工业大学生物工程与食品学院实验室筛选得到；果酒专用酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司。
氯化钠、偏重亚硫酸钾、葡萄糖、磷酸二氢氨、磷酸二氢钾、酒石酸钾钠、3，5-二硝基水杨酸、苯酚、氢氧化钠（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸（均为色谱纯）：南京源植生物科技有限公司；果胶酶（30 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；2-乙基丁酸、乙酸正丁酯：美国Sigma-Aldrich公司；酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉：国药集团化学试剂有限公司。
酵母膏蛋白胨液体培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L。
酵母膏蛋白胨固体培养基：酵母提取物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，定容至1 L。
1.2主要仪器与设备
DH4000BⅡ电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；7890A-5975B气相色谱质谱联用仪、1260 Infinity II高效液相色谱仪：美国Agilent公司；Super Alcomat高精度数显酒精浓度计：上海点将精密仪器有限公司；5424R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司；µCount3D立体计数仪，丹麦Biosense公司；T6可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；57328-U顶空固相微萃取仪：上海安谱科学仪器有限公司。
1.3试验条件
1.3.1发酵工艺
葡萄原料→除梗破碎→酶解→冷浸渍→调糖→酵母活化→接种酵母→前发酵→过滤→后发酵→陈酿→灭菌→灌装→成品。
1.3.2操作要点
葡萄原料：挑选大小一致，无病虫害、无霉变的成熟紫秋葡萄。
酶解：葡萄破碎后立即按1 g/100 L加入果胶酶（30 000 U/g），同时按60 mg/L加入偏重亚硫酸钾。
冷浸渍：浸渍温度5～8℃，浸渍时间24 h。
调糖：用白砂糖调节初始糖度至22%。
酵母活化：挑取平板上的WK与SF单菌落，分别接种到装有酵母膏蛋白胨的液体培养基中，装液量为150 mL/250 mL，于28℃、150 r/min培养36 h（此时菌体浓度应达到1×108 CFU/mL）备用；准确称取10 g RW活性干酵母，按照酵母、葡萄糖与水体积比为1∶1∶10的比例进行混合，在35℃条件下静置30 min，再加入10倍体积的紫秋葡萄汁，在28℃电热恒温培养箱中培养24 h备用。
接种酵母：1）单独发酵：WK、SF与RW酵母接种量均为1%；2）混合发酵：WK与SF（以WK+SF表示）、RW与SF（以SF+RW表示）、RW与WK（以WK+RW表示）混合接种时酵母接种比例为1∶1（体积比），总接种量为1%。
前发酵：发酵容器为不锈钢发酵罐，体积为12 L，装液量75%，发酵温度24℃，发酵时间9 d。
过滤：用四层脱脂纱布进行过滤。
后发酵：发酵温度15℃，发酵时间15 d，装液量90%。
陈酿：陈酿时加入皂土用于澄清，用量10 g/L，陈酿温度5℃，陈酿时间30 d，装液量90%。
灭菌：70℃灭菌15 min。
1.3.3菌体数量测定
酵母计数方法采用µCount3D立体计数仪，酵母在TSB中生长过夜。使用0.2 µm过滤器对10 mL 0.9%NaCl缓冲液进行无菌过滤，以去除缓冲液中的颗粒。一夜之间，酵母在Eppendorf管中稀释100倍，达到所需的起始浓度约1×107。使用µCassetteB，65 µL/室（BioSense Solutions，Farum，Denmark）测量酵母浓度，一式三份。使用µCount3D算法：细菌。实验起始浓度测量为6.97×106，样品离心管标记为“1”。对于IntuGrow平板计数，将试管“1”进一步稀释，以达到预期的20-100个菌落计数。
1.3.4理化指标测定
还原糖含量的测定采用滴定法，总酸含量的测定采用酸碱滴定法，具体步骤参考白梦洋等的方法；酒精度参照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》的方法测定；总酚含量的检测采用可见分光光度法，具体步骤参照陈红梅等的方法；花色苷的检测采用pH示差法，具体步骤参考刘彩婷等的方法。
1.3.5有机酸检测
有机酸检测参照刘晓燕等的方法并稍作修改，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：体积分数1%的甲醇溶液和0.02 mol/L KH2PO4溶液（二者体积比3∶97），用磷酸调节pH值至2.8；等度洗脱；流速0.8 mL/min；柱温30℃；进样体积10μL；波长210 nm。
标准曲线制作：分别称取酒石酸、苹果酸、乳酸与柠檬酸有机酸标准品10 mg，用流动相定容至10 mL，得到各标准品浓度为1 mg/mL的混合标准溶液，梯度稀释为1.00、0.50、0.25、0.10、0.05 mg/mL的混合标准溶液，于4℃下保存备用。
样品测定：准确称取25 mL葡萄汁或酒液，加入0.01 mol/L磷酸二氢氨试剂，定容至250 mL，取50 mL在4 000 r/min下离心10 min。取上清液，使用0.22μm滤膜过滤，将滤液装入2 mL的进样瓶中，装液量为1 mL，等待上机测定。有机酸标准曲线的回归方程及相关系数见表1。
表1 4种有机酸标准曲线的回归方程及相关系数
1.3.6挥发性成分检测
顶空固相微萃取条件：取5 mL葡萄酒于顶空瓶中，加入2 g NaCl，再加入50μL乙酸正丁酯（8.4 mg/mL）与50μL 2-乙基丁酸（9.2 mg/mL）作为混合内标，置于55℃的顶空固相微萃取仪中平衡15 min，将老化后的固相微萃取针头插入平衡后的样品顶空萃取30 min。
色谱条件：色谱柱DB WAX（60 m×0.25 mm×0.25μm）；载气为高纯He，流速1 mL/min，进样口温度230℃；采用不分流进样模式。程序升温：初始温度为40℃保持2 min，然后以5℃/min的升温速率升至90℃保持2 min，再以20℃/min的速率升至230℃，保持5 min。
质谱条件：70 eV电子能量，全扫描质量范围20～550 amu，离子源温度230℃，传输线温度280℃；四极杆温度150℃。
1.3.7感官分析
参照Englezos等和Wang等的操作方法并稍作修改。评价小组由15名感官评价人员组成（7男8女，年龄25～35岁），在通风良好、无异味的品酒室进行葡萄酒品评相关培训并组成评定小组。葡萄酒香气描述词汇为果香、花香、发酵香、草本香、甜香和整体香气强度，评分选取10分制（0为没气味，10为气味最强）：0～＜3低强度，3～＜6中等强度，6～10高强度。结果以雷达图呈现。
1.4数据处理
使用Microsoft Excel 2016对试验所得数据进行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0进行显著性分析，试验结果以平均值±标准差表示，使用Origin 2020软件进行主成分分析与作图。
相关新闻推荐
1、VgrS受体细菌组氨酸激酶在NYG培养基中的的生长曲线图