产单核细胞李氏杆菌噬菌体分离、超离、宿主谱鉴定及生长曲线绘制（二）
2结果
2.1产单核细胞李氏杆菌噬菌体的分离
利用本实验室保存的产单核细胞李氏杆菌作为宿主菌，对采集的所有污水样品利用双琼脂平板法进行分离，分离出若干株噬菌体，选取一株性状优良、传代稳定的噬菌体进行后续试验，并命名为LP8，宿主菌编号为ATCC19111(1/2a)，平板上可以观察到明显的噬菌斑，噬菌斑形状规整，边缘整齐，颜色透亮，直径2 mm左右，纯化传代稳定，无晕环(图1)。
2.2噬菌体超离
利用氯化铯密度梯度离心法对LP8噬菌体浓缩液进行超离，在密度为1.50～1.70 g·mL的氯化铯溶液梯度之间具有噬菌体层，吸取噬菌体超离液，通过效价核定，效价为4.4×10PFU·mL。
2.3噬菌体电镜观察
利用透射电镜对LP8样品进行观察，发现LP8为肌尾科噬菌体，具有标准的20面体的头部，还有一个由中空的针状结构和鞘组成的尾部，以及尾针组成的基部，噬菌体的头部直径约为80 nm；尾部长度约为120 nm(图2)。
2.4 LP8噬菌体效价的测定
对LP8噬菌体的裂解液、浓缩液、超离液进行效价测定，结果分别为1.76×10、2.67×10、4.4×10PFU·mL。
2.5 LP8噬菌体宿主谱鉴定
利用实验室所保存的产单核细胞李氏杆菌、威尔斯李氏杆菌和英诺克李氏杆菌对LP8噬菌体进行宿主谱鉴定，结果显示LP8噬菌体对18株LM都具有裂解性，对5株威尔斯李氏杆菌(C10、9-2、4-40、C59、4-43)具有裂解性，对22株英诺克李氏杆菌均无裂解性(表1)。
表1 LP8噬菌体宿主谱
2.6 LP8噬菌体生长特性
对LP8设置不同的感染比例，测定出LP8的MOI为1(图3A)；设置25、35、45、55、65、75℃温度梯度，确定LP8的最适温度为45℃(图3B)；设置pH为2、4、6、7、8、10、12梯度，确定LP8的最适pH为7(图3C)；采用的6种有机溶剂中，氯仿和异戊醇对LP8影响最大，可造成LP8全部失活，丙三醇和SM空白对照组没有影响，甲醇和乙醇会导致噬菌体部分失活(图3D)；绘制一步生长曲线，确定LP8潜伏期为23 min，对数期为23～80 min，80 min以后达到平台期，噬菌体效价最大可达到3.4×10PFU·mL(图3E)。
A.最佳感染复数；B.温度影响；C.pH影响；D.有机溶剂影响；E.一步生长曲线
2.7 LP8基因组酶切鉴定
电泳条带显示，噬菌体LP8基因组在1、2号DNA酶泳道未出现条带，在3、4号RNA泳道和5、6号绿豆核酸酶泳道都出现了条带，根据条带结果得出噬菌体基因组为双链DNA(图4)。
M.15000 DNA相对分子质量标准；1、2.DNase I；3、4.RNase I；5、6.绿豆核酸酶
2.8 LP8基因组测序
经测序，噬菌体LP8的基因组为87 038 bp，共有120个编码基因，编码基因的累加长度为76 326 bp、编码基因的平均长度为636 bp、编码区域长度占基因组的比例为87.69%。通过SnapGene软件对全基因组进行绘图，分析其基因的大小和分布情况。通过COG、KEGG、GO对LP8的基因进行注释，发现有6个编码基因参与原噬菌体合成；有20个编码基因参与噬菌体有关的生物过程；11个编码基因参与分子功能，如结合或催化；8个编码基因参与噬菌体的合成，具体生物学通路最多的为嘌呤代谢和嘧啶代谢(图5)。
图5 LP8噬菌体基因组
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