泥蚶致病性哈维氏弧菌的分离与鉴定、药敏实验结果
弧菌是海洋环境中常见的细菌种群之一，广泛分布于河口、海湾、近岸海域的海水和海洋动物体内。弧菌属种类繁多，主要致病弧菌有哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、鳗弧菌(V.anguillarum)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、霍乱弧菌(V.cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)等。哈维氏弧菌是海水养殖业重要的条件致病菌，已有研究表明，哈维氏弧菌可感染褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)、尖吻鲈(Latescalcarifer)、刺尾鱼(Acanthurussohal)、红鳍东方鲀(Takifugurubripes)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)和文蛤(Meretrixmeretrix)等重要水产养殖动物，并致其死亡，给水产养殖业带来严重的经济损失。
泥蚶(Tegillarcagranosa)属瓣鳃纲、列齿目、蚶科、泥蚶属，是我国沿海滩涂的主要养殖贝类之一，也是沿海居民青睐的生食双壳贝类之一。随着泥蚶养殖规模的不断扩大，在每年温度上升的4—5月和繁殖后的7—8月间，易发生泥蚶细菌性疾病，严重影响了泥蚶养殖效益和泥蚶养殖业。研究发现，夏季泥蚶体内的优势菌群主要是弧菌属细菌和气单胞菌属细菌；对浙江省11市泥蚶副溶血弧菌污染情况检测发现，50%为阳性。尚未见有关哈维氏弧菌感染泥蚶的报道，仅见泥蚶血红蛋白(Tg-HbⅡ)酶解多肽对哈维氏弧菌具有明显的抗菌活性的研究。2014年8月，浙江滩涂养殖泥蚶暴发大规模死亡，其主要特征为闭壳肌无力，软体部颜色发白，体液呈淡红色或无色，黏液增多。笔者自濒死的泥蚶中分离得到1株优势菌，从该菌株的形态、生理生化特征、分子生物学分类方面进行研究，以期为泥蚶病害研究提供生物学资料，为泥蚶弧菌病的防治提供科学依据。
菌株J14的分离与鉴定
哈维氏弧菌为条件致病菌，有毒株可引起养殖贝类发病、死亡。如感染哈维氏弧菌的文蛤，在发病高峰期病状特征明显，解剖患病文蛤发现，其外套膜萎缩，闭壳肌松弛、开合无力、两壳呈张开状态，软体部消瘦，部分发病文蛤的鳃黏液明显增多。本试验中，菌株J14是从夏季规模性死亡的泥蚶中分离得到的，表明菌株J14可在高温环境下生长。由人工感染试验结果可知，感染后的泥蚶出现明显的病症：外套膜萎缩，闭壳肌松弛，开合无力，软体部消瘦，有些发烂发白，肝胰腺颜色淡红，体液淡红至无色，部分患病泥蚶鳃黏液明显增多，黏液呈烟灰色。感染后死亡率高达90%。人工感染发病泥蚶的症状与自然发病的泥蚶症状表现一致，说明菌株J14具备重复感染的能力。泥蚶贝壳坚硬，如受到外界刺激，则双壳紧闭，较难通过注射方法将菌液注射到泥蚶软体部，因此本试验中采用不同密度的J14菌液浸泡感染泥蚶，分析得到菌株J14感染泥蚶的96 h半致死密度为7.74×106个/mL，表明菌株J14具有较强致病性。
对菌株J14和J19进行形态、常规生理生化鉴定，结果显示，2个菌株均为革兰氏阴性细菌，硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基平板上呈黄色，生理生化鉴定结果与哈维氏弧菌特征极为相近。与标准菌株比较，部分鉴定项存在差异，推测2个菌株可能为哈维氏弧菌。对菌株J14和J19进行16S rRNA基因分子生物学鉴定，构建的系统发育树显示，2株菌与哈维氏弧菌聚为一支。综合生理生化与分子生物学鉴定结果，确定这2个菌株均为哈维氏弧菌。
哈维氏弧菌J14的毒力基因
已有研究表明，弧菌属不同种间存在相同的毒力基因，相同的种内存在不同的毒力基因，毒力基因或相关毒力因子的转移是导致某些无毒株变为有毒株以及出现弧菌新病原的重要原因。本试验中，共检测了14种毒力基因的携带情况，结果显示，哈维氏弧菌J14和J19均携带有群体效应调控基因luxR，毒力调控基因toxR，溶血素基因vhhA、vhhB，毒力相关基因toxS，几丁质酶基因chiA，丝氨酸蛋白酶基因。Xu等对46株不同哈维氏弧菌的17种毒力基因进行PCR分析，发现所有的致病菌均含有luxR、toxRVh、vhh、chiA、丝氨酸蛋白酶基因这5种毒力基因，表明哈维氏弧菌毒力是由多基因共同作用的结果。据Nakamura等报道，毒力基因在适应不同环境和不同宿主方面具有优势，拥有很强的转移能力。另外，哈维氏弧菌致病菌株较非致病菌株可能拥有更强的接收通过基因水平转移而来的外源基因的能力。本试验中的鞭毛结构基因flaA在2个菌株中存在差异，J14不含有flaA基因，而J19含有flaA基因，由此推测，毒力基因水平转移可能是2株菌携带毒力基因差异的原因。
哈维氏弧菌J14的药敏性
药物的敏感试验结果表明，2个菌株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林和杆菌肽不敏感。文蛤源哈维氏弧菌对氨苄西林和阿莫西林不敏感；珍珠龙胆石斑鱼(Epinepheluslanceolatus♂×E.fuscoguttatus♀)源哈维氏弧菌X12XC30对呋喃唑酮、阿莫西林和红霉素耐药，X13SZ03对四环素、呋喃唑酮、利福平、复方新诺明和头孢克肟等耐药。有研究显示，不同年份、不同来源、不同养殖环境分离得到的哈维氏弧菌对抗生素的耐药存在差异，环境、宿主影响细菌的耐药性，同时抗生素的过度使用导致细菌产生更广的耐药性。本试验中的2株哈维氏弧菌对26种药物敏感，其中氯霉素、呋喃唑酮、头孢哌酮、头孢曲松、头孢噻吩、头孢拉啶、诺氟沙星、氧氟沙星属于水生食品动物禁用药，因此在泥蚶弧菌病的防治过程中应合理合规用药，通过改善泥蚶养殖环境水质和底质，以达到生态防治的目的。
结论
从浙江滩涂发病泥蚶中分离得到优势菌株J14，经生理生化试验和16S rRNA基因序列分析，确定为哈维氏弧菌，该菌株具有较强的致病性，携带7种毒力基因，对庆大霉素、卡那霉素、复方新诺明等26种常用抗生素药物敏感。