丙酸钙、山梨酸钾对面包腐败真菌的时间生长的功效
烘焙产品是中等水分食品（约0.95 a w；pH 5.0-6.0），因此如果不添加控制策略（例如食品级防腐剂、气调包装和储存以及使用保湿剂。随着消费者减少防腐剂使用的压力，现在正在寻找替代的天然防腐剂。然而一些腐败真菌已经进化为对现有使用的防腐剂更具耐受性。因此需要关于重要腐败霉菌对此类发酵烘焙食品中使用的防腐剂的相对敏感性/抵抗力的更准确数据。大多数这些防腐剂被食品和药物管理局(FDA)普遍认为是安全的(GRAS)，这通常意味着它们可以用于控制原材料和成品中的微生物污染（Garcia-Garcia和Searle，2016年）。然而，一些报告表明对这些防腐剂存在耐受性。例如，P.roqueforti菌株被发现对面包中使用的推荐浓度的丙酸钙(CP；3,000 ppm)具有抗性，并且被发现在处理过的面包基质中生长。
用于细菌和酵母研究的Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析系统也可以通过对液体肉汤培养基的细微修改用于丝状菌生长测定。这使得能够快速筛选新化合物的功效、产霉菌毒素腐败真菌的生长生态和霉菌毒素产生，以及生物防治剂配方的比较。本研究的目的是检查从明显变质的面包中分离出的三种不同真菌菌株（H.burtonii(HB17)、P.variotii(PV10)和P.roqueforti(PR06)]）的相对敏感性/耐受性。使用Bioscreen C检测系统测定一系列浓度(0–128 mM)CP和山梨酸钾(PS)对其时间生长的功效。有助于比较这两种防腐剂对(a)与温度（25和30°C）、水分活度（a w,0.95,0.97)和pH(5.0,5.5)和(b)使用相对检测时间(TTD)值来确定这三个物种中的哪一个可能对这两种食品级防腐剂更敏感/更有弹性。
Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪用于量化不同浓度的防腐剂对微生物随时间生长的功效。在100孔微量滴定板中装入200μl具有防腐处理条件（pH;a w）的半固体YES培养基，并用每种菌株的孢子悬浮液接种。使用600 nm波长每20分钟记录一次光密度(OD)的时间变化，持续6天（8,640分钟），因为它与真菌生物量的变化直接相关，获得相关微生物的生长曲线。实验分别是在25°C和30°C下进行，每个处理重复5次，实验重复一次。
实验结果：利用快速浊度法测定系统(Bioscreen C)来检查丙酸钙(CP)和山梨酸钾(PS)控制重要面包腐败真菌生长的时间效力。目的是比较三种重要的腐败真菌Hyphophichia burtonii(HB17)、Paecilomyces variotii(PV11)和Penicillium roqueforti的菌株的时间增长(PR06)从明显模制的面包中分离到(a)不同浓度的CP和PS(0–128 mM)，(b)温度(25°C,30°C)，(c)水分活度（a w；0.95，0.97)和(d)pH(5.0,5.5)。所有三个非生物因素，pH、a w和温度以及防腐剂浓度都会影响所检查物种的相对生长。总的来说，PS在抑制这三个物种的菌株生长方面比CP更有效。此外，还比较了在相互作用的非生物因素下防腐剂功效的检测时间(TTD)。Paecilomyces variotii(PV10)菌株对防腐剂的耐受性最强，两种防腐剂的TTD值都最短。P.roqueforti在所有检查的条件下，是最敏感的，具有最长的TTD值。
图1、在含有不同浓度的丙酸钙(CP)和(C,D)山梨酸钾(PS)的情况下，拟青霉菌(PV10)在(A,B)和山梨酸钾(PS)的半固体酵母提取物蔗糖(YES)培养基中的生长曲线（0–128 mM)使用BioScreen(C)培养超过6天。每条曲线代表五次重复的平均值。
图2、在(A)25°C和(B)30°C下，CP对Hyphophichia burtonii(HB17)生长（8,640分钟，6天）的影响。PS对生长的影响分别显示在(C)25°C和(D)30°C中。从图中显示了CP和PS在6天后对H.burtonii生长的相对抑制作用。PS在控制(p<0.05)H.burtonii(HB17)生长方面具有显著的效果。对于CP，在25°C/pH 5.0和0.97 a w下，与相同浓度的其他处理相比，这种腐败酵母更具弹性并且能够有效生长。6天后，测试的最高浓度在0.95 a w（OD 0.83和0.86，p<0.05）和25°C下具有良好的功效。对于PS，在25°C和30°C观察到显著的(p<0.05)抑制作用，在0.95 a w中检测到的最高浓度（64和128 mM）处理（见图1C、D）。在30°C时，有效抑制需要最高浓度(128 mM)。
图3、HB17在(A)25°C和(B)在不同浓度CP存在下的检测时间（TTD；OD=0.4 OD；6天）；对于PS在(C)25°C和(D)30°C。在25°C存在CP的情况下，H.burtonii(HB17)的TTD周期最长。在0.97 a w处理中，在4和16 mM浓度下，这些时间>5.0天（图3A）。在30°C下，最长TTD值（p<0.05）在0.95 a w处获得（图3B）。对于PS，需要测试的最高防腐剂浓度(128 mM)才能有效控制30°C的生长。
图4、P.variotii(PV10)在(A)25°C和(B)在30°C在不同浓度的CP存在下的TTD（OD=0.4 OD；6天）；对于PS在(C)25°C和(D)30°C。P.variotii(PV10)菌株在25°C下耐受所有CP浓度。事实上，在30°C时，增加CP的浓度似乎会刺激生长（图4A、B）。然而，该菌株无法在pH 5.0和>32 mM PS下开始生长（p<0.05）。对于P.variotii，将温度提高到30°C会导致PS更好的抑制，主要是在pH 5.0时，在实验时间范围内（6天；图4C、D）没有开始生长。
图5、在(A)25°C和(B)在不同浓度的CP存在下，Penicillium roqueforti(PR06)的TTD-监测时间）（OD=0.4 OD；6天）；对于PS在(C)25°C和(D)30°C。无论是否存在防腐剂，尤其是在检查较高pH值时，P.roqueforti(PR06)菌株显示了最长TTD周期。
总结：面包的真菌腐败是食品工业中一个持续存在的问题，需要使用防腐剂来在环境储存条件下为此类产品获得必要的保质期。本论文研究直接从生产设施中的变质面包中分离出这些菌株，在分离的不同真菌物种中，普遍发现了H.burtonii，因为已知它是造成面包“发霉”缺陷的原因。P.variotii和P.roqueforti也经常在卫生条件差的面包店生产工厂中发现。这是第一次使用Bioscreen C快速生物测定系统详细研究面包/烘焙产品生产过程中常用防腐剂的效果以及防腐剂对控制此类腐败真菌的可能不同影响。本研究表明，使用该系统可以获得一致且可重复的结果，以比较这两种常用防腐剂在不同相互作用的非生物条件下模拟发酵面包产品中的条件/防腐剂对生长的相对控制的功效。总的来说，PS在控制H.burtonii和P.variotii的生长方面比CP更有效，但对P.roqueforti尚不清楚.此外应用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪这可能是一种有价值的快速替代工具，可用于挑战测试以检查使用不同防腐剂时新配方烘焙产品的保质期。