柑桔砂皮病菌座壳菌生长条件及纳米药剂筛选（一）
柑桔是我国重要的经济作物。近年,由子囊菌门真菌柑桔间座壳菌Diaporthecitri(无性态为柑桔拟茎点霉菌Phomopsiscitri,属于半知菌类拟茎点霉属)侵染引发的病害发展成为我国柑桔主要病害,因受害部位及症状不同,分别被称为砂皮病(侵染叶片、小枝及幼果,患病组织表面常有紫褐色至黑褐色硬质、略突出的胶点,呈现为砂皮状)、树脂病(侵染枝干)、蒂腐病(侵染贮藏期果实)。防控该病原菌的为害主要依靠化学防治,三唑类、多菌灵、甲基硫菌、吡唑醚菌酯等杀菌剂效果良好。目前我国农药剂型主要为乳油和可湿性粉剂等,载药颗粒大,分散性能差,导致农药易流失,利用率不高。近年来,纳米材料在农业生产上得到应用,纳米试剂可以改善农药对靶标的亲和性,减少流失与分解,控制药物释放速率,延长持效期,降低其在非靶标区域和环境中的投放量与残留污染,从而实现农药的减量增效。
本试验从重庆市长寿区“爱媛38”(现在普遍被称为“红美人”)杂柑园采集典型砂皮病叶,分离纯化及鉴定病原菌,研究其生物学特性,筛选对其具抑制作用的纳米药剂,以期为防控该菌侵染为害提供参考。
1材料与方法
1.1材料
2021年4—5月从重庆市长寿区“爱媛38”柑桔园采集砂皮病典型症状病叶。
培养基包括马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA,马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L)、马铃薯蔗糖培养基(PSA,马铃薯200 g,蔗糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L)、胡萝卜琼脂培养基(CA,胡萝卜200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,蒸馏水1 L)、燕麦琼脂培养基(OA,燕麦片30 g,琼脂15 g,蒸馏水1 L)、Czapek培养基(硝酸钠2 g,磷酸氢二钾1 g,氯化钾0.5 g,硫酸亚铁0.01 g,硫酸镁0.5 g,蔗糖30 g,琼脂20 g,水1 L)。
纳米试剂包括土霉素碳量子点(OTC-CQDs)纳米试剂(西南大学柑桔研究所提供)、SiO2纳米试剂(山东农业大学植物保护学院提供)和星状阳离子聚合物(SPc)纳米载体(中国农业大学植物保护学院提供)。
杀菌剂包括32%噻呋·氟环唑SC(山东省青岛瀚生生物科技股份有限公司生产)、430 g/L戊唑醇SC(拜耳股份公司生产)和40%吡唑醚菌酯·喹啉铜SC(江西中迅农化有限公司生产)。
1.2方法
1.2.1病原菌分离与鉴定采用组织分离法,在病叶上取病健交界处组织3～4块,消毒后放于PDA培养基上28℃恒温培养7 d,纯化分离菌株,然后接种于PDA培养基上24℃培养7 d,观察菌落培养性状、产孢结构、分生孢子形态特征等。
采用科赫氏法则鉴定分离菌株的致病性。将分离菌株培养7 d后,接种菌饼在柑桔果实刺伤处,以接种无菌PDA培养基为对照。使用无菌水浸湿脱脂棉保湿,28℃培养24 h后观察症状。取接种果实发病处组织再次分离病菌,与接种菌进行比较。
提取分离菌株DNA进行分子鉴定。用灭菌的直径5 mm的打孔器取菌饼,接种于PDA培养基上24℃恒温保湿培养。当菌落扩展到培养皿的2/3时,用灭菌的接种铲轻轻地刮取菌丝,置于灭菌研钵中加入液氮充分研磨,至粉末状。用灭菌药匙将菌丝粉末转移到灭菌的1.5 mL离心管中,采用真菌DNA提取试剂盒提取菌株DNA,然后利用真菌通用引物ITS1/ITS4对菌株进行PCR扩增。PCR反应体系含有2×Taq PCR MasterMix 12μL,引物ITS1 1μL,引物ITS4 1μL,模板DNA 2μL,ddH2O 9μL。PCR反应程序为94℃预变性4 min→(94℃变性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环)→72℃延伸10 min。扩增产物于4℃保存。将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测浓度,然后用紫外凝胶成像系统观察,检测到单一清晰的条带,纯化后送测序公司测序。对测序所得序列,在NCBI(http://www.ncbi.nlm.gov)数据库中进行BLAST同源性比对,然后基于GenBank中报道的其他病原菌的序列信息,利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)通过MEGA4.1软件构建系统发育树。
1.2.2病原菌生物学特性设置不同的碳源、氮源、光照、温度及pH值等,观测不同培养条件对分离菌株菌丝生长的影响。
培养基的影响:将直径5 mm的菌饼接种在PDA、PSA、CA和OA平板上,将接种好的平板倒置在25℃恒温培养箱中培养,每个处理重复3次,培养7 d后观察培养性状,用十字交叉法测菌落直径,计算菌丝生长速度。
碳源的影响:基础培养基为Czapek培养基,把Czapek培养基的蔗糖分别换为相同碳量的乳糖、甘油、麦芽糖、可溶性淀粉和甘露醇葡萄糖,以配制不同碳源的培养基,接种直径5 mm菌饼,每处理重复4次,25℃恒温培养箱培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径,培养10 d后观察培养性状。
氮源的影响:基础培养基为Czapek培养基,把Czapek培养基的硝酸钠分别换为相同氮量的尿素、蛋白胨、赖氨酸、甘氨酸和氯化铵,以配制不同氮源培养基,接种直径5 mm菌饼,每处理重复4次,25℃恒温培养箱培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径,培养10 d后观察培养性状。
光照的影响:将直径5 mm菌饼接种PDA平板上,置于25℃恒温培养,分别设置24 h全光照、12 h光暗交替和24 h全黑暗培养等光照条件,每处理组重复4次,培养3 d后用十字交叉法测量菌落直径,培养10 d后观察培养性状。
温度的影响:将直径5 mm菌饼接种到PDA上,分别置于15、20、25、30、35℃等温度条件下进行完全黑暗培养,每处理重复4次,培养2 d后用十字交叉法测量菌落直径,培养7 d后观察培养性状。
pH值的影响:PDA培养基灭菌后,在无菌条件下利用盐酸和氢氧化钠溶液将PDA培养基pH值分别调为5、6、7、8和9,制成不同pH值的平板,接种直径5 mm菌饼,每处理重复4次,25℃恒温培养箱培养2 d后用十字交叉法测量菌落直径,培养7 d后观察培养性状。
1.3不同试剂对病菌抑制作用测定
供试各纳米试剂和抑菌剂各配成一定浓度溶液,分别与PDA混合制成含药平板,使含药平板中供试药剂最终浓度分别为10、1、0.1、0.01、0.001μg/mL等5个浓度处理,以加入等量无菌水的培养基为对照,每处理重复3次,接种直径8 mm菌饼于平板中央,28℃恒温培养7 d后,采用十字交叉法测量菌落直径,计算各处理菌丝生长抑制率。抑制率(%)=[(对照菌落直径-药剂处理菌落直径)/(对照菌落直径-8)]×100。使用GraphPad prism 8软件统计分析数据,将药剂浓度换算成浓度对数(x),菌丝生长抑制率换算成抑制概率值(y),计算毒力回归方程、相关系数(r)及抑制中浓度(EC50)。