不同浓度的全反式维甲酸对胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS细胞生长影响
全反式维甲酸（All-trans-retinoic acid，ATRA）属于类维甲酸家族成员，是维生素A的活性代谢产物，在细胞增殖、分化、凋亡和胚胎发育中具有重要作用。ATRA被认为是第一个肿瘤治疗的靶向药物，在临床上主要用于治疗急性早幼粒白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）。APL是急性髓系白血病的一种独特亚型，表达早幼粒细胞白血病~维甲酸受体α（PML-RAR-α）癌蛋白，其特征在于纤溶酶产量增加导致严重出血。ATRA通过抑制纤溶酶的产生和降低膜联蛋白A2和S100A100的表达在诱导白血病细胞分化、促进细胞凋亡以及改善出血症状等方面发挥了重要作用。ATRA的临床应用将APL从一种高度致命的癌症转化为一种高度可治愈的疾病。
由于ATRA在APL中的临床应用取得了巨大的成功，ATRA在治疗多种人类恶性肿瘤方面得到了广泛的研究。然而，APL的遗传和生理病理简单性在人类肿瘤中是相当罕见的，APL因此是目前发现的唯一对ATRA作出有效反应的恶性肿瘤。越来越多的研究表明，ATRA可以增强其它化疗药物的抗癌效应：在体外，ATRA与顺铂联合应用可显著抑制肝癌细胞的生长，促进其凋亡。ATRA与多西他奇（docetaxel）或泰索帝（taxotere）联合应用可促进前列腺癌和乳腺癌细胞死亡的诱导。有机砷化三聚氰胺（Organic arsenical melarsoprol）与ATRA联合使用可明显抑制人乳腺癌和前列腺癌细胞的体外和体内生长。ATO（arsenic trioxide）还可与ATRA协同抑制人肝癌、乳腺癌和肺癌细胞的生长和凋亡。
受细胞系以及培养条件的影响，不同细胞对特定药物的耐受性不同，在ATRA的使用中发现不同细胞的ATRA有效浓度不同：类维生素A 6-OH-11-O-羟基菲汀（6-OH-11-O-hydroxyphenantrene，IIF）是ATRA的合成衍生物。体外研究表明IIF可有效抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。40μmol/L和80μmol/L的IIF处理24h可显著诱导SaOS-2细胞凋亡，但对U2OS细胞没有明显效应。用5～50μmol/L的ATRA处理PANC-1细胞1-6 d，可呈剂量/时间依赖性抑制PANC-1细胞生长。1～10μmol/L维甲酸衍生物在多种肿瘤细胞中具有显著的抗肿瘤作用，也有文献报道10倍低浓度（100～500nm的）ATRA可以抑制人髓母细胞（Medulloblastoma，MB）的增殖。但是，一些研究发现吸烟者如果摄入维甲酸会导致肺癌发病率增高，暗示维甲酸可能具有促进肿瘤发生的作用。在五种鳞状细胞癌（squamous cell carcinom，SCC）细胞中，20 nmol/L ATRA可导致细胞数增加30%，而40～100 nmol/L ATRA则可将细胞增殖减少20～30%[10].
硼替佐米（Bortezomib，BTZ，商品名Velcade，PS-341）是用于治疗多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）的临床药物。研究表明BTZ通过可逆地抑制蛋白酶体β5亚基的糜蛋白酶样活性，从而抑制泛素蛋白酶体系统，进而通过各种机制诱导细胞死亡，包括抑制核因子~Kβ的活性，激活p53，积累错折叠蛋白等。
不同浓度的ATRA是否会对胰腺癌PANC-1和骨肉瘤U2OS细胞产生不同的影响还未有研究，因此在本文中我们用浓度跨度较大的ATRA处理这两种细胞。实验结果表明，不同浓度的ATRA对PANC-1和U2OS细胞生长的影响不同，低浓度的ATRA促进PANC-1和U2OS细胞生长，高浓度则抑制其生长。我们还发现，BTZ可以通过凋亡途径促进细胞死亡，ATRA的促生长或抑生长的作用都可被BTZ调控，同时低浓度ATRA与BTZ联合应用会降低凋亡前蛋白Procaspase3的表达，表明联合用药可能影响细胞的凋亡途径。
实验结果
ATRA浓度不同对细胞生长的影响不同
实验中用不同浓度的ATRA（5、10、20、40、80、100、150、200μmol/L）分别处理PANC-1和U2OS细胞24h，采用MTS法检测ATRA对细胞活力的影响。结果显示，ATRA对PANC-1细胞的生长依据浓度的不同而有不同的效果。在PANC-1细胞中，低浓度（20，40，80，100μmol/L）的ATRA表现出显著的促进生长的趋势（P<0.001）。相反的，高浓度（200μmol/L）ATRA可明显抑制PANC-1细胞的生长。有趣的是，极低浓度的ATRA（5μmol/L）则表现出对PANC-1细胞生长的抑制作用（P<0.05），抑制率为89.50%±0.199（图1A，表1）。在U2OS细胞中，我们也观察到类似的现象。低浓度（10，20，40，80μmol/L）的ATRA可促进细胞的生长，特别是20，40μmol/L（P<0.01）。随着浓度的升高，150，200μmol/L的ATRA表现出对U2OS细胞生长的显著抑制作用（P<0.001）（图1B，表1）。与PANC-1细胞不同的是，5μmol/L的ATRA并不能抑制U2OS细胞的生长，这个独特现象暗示PANC-1细胞中可能存在与U2OS细胞不同的ATRA应答方式。
高浓度ATRA抑制细胞生长的能力可被BTZ增强
为进一步检测BTZ对ATRA作用的影响，我们继续进行了高浓度ATRA联合BTZ的用药实验。采用200μmol/L ATRA和40 nmol/L BTZ单独或联合处理PANC-1或U2OS细胞24 h，MTS实验检测细胞活力。结果显示，高浓度的ATRA可以显著抑制PANC-1和U2OS细胞的生长（P<0.001），联合应用ATRA和BTZ可明显抑制PANC-1和U2OS细胞的生长（P<0.001）（图2，表2），与单独应用ATRA相比，联合用药组都具有显著差异（PANC-1,P<0.001;U2OS,P<0.01）；与单独应用BTZ相比，联合用药同样具有显著差异（P<0.01）（图2）。