纳米材料Cu2-xSe NCs可在1 h内杀死所有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、革兰氏阳性菌
2结果与讨论
2.1硒化铜纳米晶体的表征
用水热法合成的Cu2-xSe NCs分散均匀且粒径均一，约为12.8 nm，因其独特的铜缺陷结构而在近红外区具有强烈的局域表面等离子体共振吸收。此外，由于所用包被剂为CTAB，所以该Cu2-xSe NCs表面带正电。Cu2-xSe NCs的表征结果见图2。
图2 Cu2-xSe NCs的表征。(A)Cu2-xSe NCs的透射电镜(TEM)图像;(B)Cu2-xSe NCs的粒度分布，其通过在视野中随意计数100个颗粒而获得;(C)Cu2-xSe NCs的UV-Vis吸收光谱；(D)Cu2-xSe NCs和H2O的Zeta电位
2.2硒化铜纳米晶体对常见致病菌的抗菌活性
本实验从Cu2-xSe NCs对E.coli和S.aureus的细菌存活率、MIC和MBC三个方面考察其抗菌活性。如图3所示，随着Cu2-xSe NCs浓度的增加，无论是E.coli还是S.aureus，其细菌存活率都逐渐下降。此外，Cu2-xSe NCs对S.aureus的影响明显强于对E.coli的影响。对于E.coli，当Cu2-xSe NCs的浓度为32μg/mL时，细菌存活率为0，即无细菌生长，而对于S.aureus，只需4μg/mL的Cu2-xSe NCs已可以抑制其生长。Cu2-xSe NCs对常见致病菌的MIC测定进一步证实了上述结论。因MIC是指引起细菌肉眼观察下未见生长的药物最低浓度，故我们选择肉眼可见细菌培养液澄清透明的EP管对应的Cu2-xSe NCs浓度为该材料的MIC。如图4所示，Cu2-xSe NCs对E.coli的MIC为32μg/mL，对S.aureus的MIC为4μg/mL。这一现象也和其细菌存活率结果一致。
图3 Cu2-xSe NCs对E.coli(A)和S.aureus(B)细菌存活率的影响
图4 Cu2-xSe NCs对常见致病菌的MIC(Cu2-xSe NCs浓度单位为μg/mL)
以MIC为界，将MIC及其后未长菌试管和MIC的前一个试管中的培养液取200μL转移到干净的固体LB培养基上，涂板并在37℃全温摇床中孵育12 h，观察细菌生长情况，结果见图5。对于E.coli，Cu2-xSe NCs的最小杀菌浓度MBC为32μg/mL，而对于S.aureus，Cu2-xSe NCs的最小杀菌浓度MBC则为4μg/mL。
图5 Cu2-xSe NCs对常见致病菌的MBC
2.3硒化铜纳米晶体对耐药菌株的抗菌活性
图6 Cu2-xSe NCs对E.coli耐药菌株(A)和S.aureus耐药菌株(B)细菌存活率的影响
考察了Cu2-xSe NCs对耐药菌株的抗菌活性，其内容为Cu2-xSe NCs对E.coli耐药菌株和S.aureus耐药菌株的细菌存活率、MIC和MBC三个方面。如图6所示，Cu2-xSe NCs对耐药菌株细菌存活率的影响和对其普通菌株的影响相似，对于E.coli耐药菌株，当Cu2-xSe NCs浓度为32μg/mL时，细菌存活率为0，而对于S.aureus耐药菌株，只需4μg/mL Cu2-xSe NCs。
Cu2-xSe NCs对耐药菌株的MIC也和对其普通菌株的MIC一致，对于E.coli耐药菌株和S.aureus耐药菌株，MIC分别为32μg/mL和4μg/mL(图7)。而Cu2-xSe NCs对耐药菌株的最小杀菌浓度MBC则不太相同(图8)。对于E.coli耐药菌株，Cu2-xSe NCs的MBC为32μg/mL，对于S.aureus耐药菌株，Cu2-xSe NCs的MBC为8μg/mL，和Cu2-xSe NCs对S.aureus普通菌株的MBC 4μg/mL相比，略高。
图7 Cu2-xSe NCs对耐药菌株的MIC(Cu2-xSe NCs浓度单位为μg/mL)
图8 Cu2-xSe NCs对耐药菌株的MBC
2.4硒化铜纳米晶体的抑菌动力学
为了探究Cu2-xSe NCs对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的的抑菌动力学，我们测定了细菌生长曲线和时间-杀菌曲线。如图9所示，对于E.coli，细菌在孵育2 h后开始进入对数生长期，直至12 h后进入平台期。随着Cu2-xSe NCs浓度的逐渐增加，虽然细菌的生长趋势并未改变，但是增长速度逐渐减小，当其浓度为16μg/mL时，细菌在孵育8 h后才进入对数生长期并于12 h后进入平台期；而当Cu2-xSe NCs浓度增加到32μg/mL时，即达到MIC时，细菌不再生长。对于S.aureus，细菌在孵育1 h后就开始进入对数生长期，12 h后进入平台期。并且S.aureus受Cu2-xSe NCs浓度影响更大，随着其浓度的逐渐增加，细菌的增长速度大幅降低。当Cu2-xSe NCs浓度到达MIC时，细菌基本不生长。再一次证明了S.aureus对Cu2-xSe NCs更敏感。
图9 Cu2-xSe NCs抑制常见致病菌的生长曲线
时间-杀菌曲线可以评估一种抗菌药物对细菌的杀菌速率。我们取Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC进行实验(图10)。对于E.coli，当Cu2-xSe NCs浓度为0或者0.5倍MIC时，细菌数目持续增长，但当其浓度到达32μg/mL，即Cu2-xSe NCs对E.coli最小杀菌浓度MBC时，细菌在1 h内全部死亡。对于S.aureus，当Cu2-xSe NCs浓度为0时，细菌不断生长，但随着其浓度的增加，细菌逐渐减少，当其到达Cu2-xSe NCs对S.aureus最小杀菌浓度的MBC(4μg/mL)时，细菌在8 h内全部死亡。伴随着Cu2-xSe NCs浓度的不断增大，细菌死亡时间愈来愈短，当其为32μg/mL时，细菌在1 h内全部死亡。即，当Cu2-xSe NCs浓度为32μg/mL时，不管是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，都会在1 h内全部死亡，证明了Cu2-xSe NCs拥有较强的杀菌性能。
图10 Cu2-xSe NCs抑制常见致病菌的时间-杀菌曲线
图11 Cu2-xSe NCs中Cu2+的释放曲线
2.5硒化铜纳米晶体的抗菌机制
在抗菌剂抗菌机制研究中，较为公认的有四种途径：其一，金属离子接触反应，这也是无机抗菌剂最普遍的抗菌作用机理；其二，催化激活机理，即通过催化产生活性氧物质从而杀死细菌；其三，阳离子固定机理，即抗菌剂携带阳离子基团，以此固定负电荷的细菌，从而使其接触性死亡并破坏细胞壁和细胞膜；其四，细胞内容物、酶、蛋白质、核酸损坏机理，这是许多有机抗菌剂的抗菌机理。为考察Cu2-xSe NCs的抗菌机制，我们首先测定Cu2-xSe NCs中Cu2+的释放曲线(图11)，不断增加的Cu2+浓度证明了Cu2-xSe NCs可以持续释放Cu2+，从而实现持久抗菌的作用。其次，我们使用了活性氧(ROS)荧光探针DCFH-DA，并通过荧光共聚焦分析Cu2-xSe NCs与细菌作用是否有活性氧物质的产生，通过实验我们发现Cu2-xSe NCs并不会产生ROS，即不是通过催化激活机理杀死细菌。Zeta电位(图2D)证实Cu2-xSe NCs因其包被剂为CTAB，一种带季胺盐基团的阳离子表面活性剂而带正电，证明Cu2-xSe NCs可通过阳离子固定机理实现杀菌。最后我们考察了细胞内容物、酶、蛋白质、核酸损坏机理，实验结果证明Cu2-xSe NCs并不能通过该途径灭菌。
综上所述，Cu2-xSe NCs的杀菌性能主要依靠金属离子接触反应和阳离子固定机理实现。
3结论
本实验研究发现，Cu2-xSe NCs拥有较强的杀菌性能，对常见的E.coli(革兰氏阴性菌)和S.aureus(革兰氏阳性菌)表现出杀菌活性，并且对其耐药菌株具有良好抑菌能力，而S.aureus对Cu2-xSe NCs更为敏感，这是由于E.coli具有双层膜而S.aureus仅拥有单层膜。此外，当Cu2-xSe NCs浓度为32μg/mL时，不管是革兰氏阳性菌还是革兰氏阴性菌，都会在1 h内全部死亡，证明了Cu2-xSe NCs拥有较强的杀菌性能。因此，在新型抗菌药的研究中，纳米材料Cu2-xSe NCs具有成为新型抗菌剂的潜力。
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