茂源链霉菌提高谷氨酰胺转氨酶产量方法【研究进展】
茂原链霉菌高效合成耐热谷氨酰胺转胺酶
近日，Journalof Agricultural and Food Chemistry在线发表了江南大学未来食品科学中心和生物工程学院陈坚院士团队刘松研究员课题组的研究成果“Efficient Production of a Thermostable Mutant of Transglutaminase by Streptomyces mobaraensis”（Ye et al.,J.Agric.Food Chem.,2024.72(8):4207-4216.）。2021级硕士叶佳才为论文第一作者，刘松研究员为通讯作者，论文作者还包括周景文教授和堵国成教授。
谷氨酰胺转氨酶（EC 2.3.2.13，TGase）能够催化蛋白质发生共价交联，广泛应用于肉制品、乳制品和豆制品等蛋白基食品的质构改良，并在制药、纺织和皮革等非食品领域具有良好的应用前景。茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）食品添加剂国家标准GB2760规定的TGase生产菌株，是商品TGase的主要来源。然而，天然S.mobaraensis TGase热稳定性差，应用领域受限。前期研究中，本团队对S.mobaraensis TGase进行了理性改造，得到的突变体TGm2 60℃半衰期较野生酶提高33.45倍（J.Agric.FoodChem.,2021,69:15268−15278）。
然而，上述研究中TGm2只在大肠杆菌中进行少量合成，并不适于工业化生产。因此，实现耐热TGase在食品安全菌株S.mobaraensis中的高效合成十分迫切。
针对上述问题，本研究团队结合随机诱变及定点基因整合在S.mobaraensis中高效合成了TGase耐热突变体TGm2。首先，对S.mobaraensis DSM40587进行ARTP诱变，筛选到一株TGase产量增加12.2倍的突变体smY2022，并确定了启动子核心区域（“-10区”G->A）的突变是导致其高产的重要原因。然后，优化了同源臂的长度提高了S.mobaraensis基因组中双交换同源重组的效率，并将smY2022中野生型TGase的编码序列替换为耐热突变体TGm2的基因，得到重组菌株smY2022-TGm2，胞外TGase活性达到61.7 U/mL，是目前报道的TGase酶活最高的S.mobaraensis菌株。进一步对TGm2的催化性能进行了表征。在60°C时，TGm2的半衰期和比活性分别达到64 min和71.15 U/mg，分别是野生型TGase的35.6倍和2.9倍。进一步比较了野生型TGase和TGm2对大豆分离蛋白、酪蛋白、乳清蛋白及牛血清蛋白的交联能力。结果表明这2种酶在40°C时具有相似的能力，但TGm2在70°C时表现出明显优于野生型TGase的蛋白交联能力。上述结果表明，smY2022-TGm2能够高效合成耐热TGase，具有良好的工业化应用前言。
利用ARTP反复诱变茂源链霉菌提高谷氨酰胺转氨酶产量
本期向您推荐华东理工大学许建和教授、李春秀副教授科研团队，采用ARTP诱变育种技术处理茂源链霉菌，通过8轮ARTP诱变，获得多株高产谷氨酰胺转氨酶（TGase）高产突变株，其中突变株Sm5-V1 TGase产量达到5.85 U/mL。该研究成果于2017年发表在《Bioresources and Bioprocessing》上（题目：Enhancing transglutaminase production of Streptomyces mobaraensis by iterative mutagenesis breeding with atmospheric and room‑temperature plasma(ARTP)）。
谷氨酰胺转氨酶(TG酶)又称为蛋白质-谷氨酸-γ-谷氨酰胺转氨酶，能够催化蛋白质分子之间或之内的交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺残基的水解，从而改善蛋白质的结构和功能。因此，在食品、医药等领域有广阔的应用前景。目前，应用在食品工业领域的谷氨酰胺转氨酶主要由茂源链霉菌发酵生产。鉴于食品上对基因工程菌的限制，因此用诱变的方法选育TG酶高产菌株。
许建和教授、李春秀副教授科研团队利用ARTP技术对茂源链霉菌ECU7480进行8轮诱变处理，共选择了501个突变株进行试管发酵筛选，研究多次反复诱变对TGase产量提升的累积效应。通过统计学分析得出结论，菌株的正突变率随着诱变次数的增加而升高，而且最佳突变株TGase的产量也随着反复诱变次数增多呈现波动性提升的趋势。最终，选育出四株高产菌株Sm5-V1,Sm6-V13,Sm2-V10,and Sm7-V12,其中Sm5-V1 TGase产量比出发菌株提升27%，达到5.85 U/mL，经过8代遗传后仍然保持稳定。充分证明ARTP作为一种新型诱变手段，是工业育种的良好工具。
通过实时定量PCR分析和基因测序研究得出，与出发菌株分泌的TG酶相比，高产突变株TG酶酶原的结构基因pro-smtg核苷酸序列并没有发生改变，但pro-smtg的表达水平明显提升，这可能是TG酶产量提高的原因。本研究针对目标基因序列和转录水平的分析，为进一步研究ARTP诱变产生的代谢过程的改变提供了重要的指导。
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