瘢痕疙瘩MSCs生长曲线与发病机制研究（一）
目的探索获得瘢痕疙瘩来源的高纯度间充质干细胞(MSCs)的培养方法。方法来源于第四军医大学唐都医院皮肤科住院的4例患者的瘢痕疙瘩标本，所取病变部位均位于前胸及后背皮肤，采用DMEM∶F12/(100 mL/L)胎牛血清(FBS)初步培养，再改用低糖DMEM/(100 mL/L)FBS培养，接着用低糖DMEM/(10 mL/L)FBS培养，最后用无血清的干细胞培养基(SCM)培养，并通过观察细胞形态特征及应用流式细胞术检测细胞表面标记物的表达情况进行鉴定。结果经血清梯度培养后得到了长梭形、形态均一，纯度较高的纤维样细胞，经流式细胞仪检测后细胞表面标记物表达情况为：CD29为99.99%，CD44为99.7%，CD45为0.69%，CD73为99.96%。结论血清浓度逐渐降低的梯度培养法可获得高纯度的瘢痕疙瘩MSCs。
瘢痕分为生理性瘢痕和病理性瘢痕，而病理性瘢痕又分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩主要由局部创伤和表皮异位等造成真皮损失和胶原的异常聚集所致，在临床上表现为呈“蟹足样”浸润性生长[1]。一般不自行萎缩，切除后易于复发，但一般不会发生转移和恶变[2]。目前瘢痕疙瘩的发病机制不清，也无理想的治疗方法[3]。而间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是来源于早期中胚层的一类多能干细胞，目前已经从骨髓、骨膜、皮肤等组织处分离得到MSCs[4]。有报道表明，瘢痕疙瘩中MSCs的数量要比正常皮肤中的多[5]，但是其作用机制尚不明确。因此，对MSCs的研究成为瘢痕疙瘩发病机制研究的一个重要方面。目前对于瘢痕疙瘩MSCs的分离培养一般借鉴正常皮肤MSCs的培养方法，但一般培养周期长，和成纤维细胞呈混杂生长，难以分离出纯度高的干细胞。因此，探讨瘢痕疙瘩MSCs的培养方法对瘢痕疙瘩发病机制的研究具有重要的意义。
1材料与方法
1.1标本来源瘢痕疙瘩标本来源于第四军医大学唐都医院皮肤科住院的4例患者，患者均为初次就诊，此前未接受过其他治疗，无全身其他器质性疾病，病变部位均位于前胸及后背。经患者知情同意后，以手术及电子线照射治疗瘢痕疙瘩病变，同时经病理诊断确诊为瘢痕疙瘩，留取标本备用。
1.2主要试剂及仪器2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon)，胎牛血清(FBS，Gibco)，干细胞培养基(Cell Therapy Systems STEMPRO MSC SFM CTSTM,Gibco)，Ⅱ型中性蛋白酶(DispaseⅡ,Roche)，CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE、CD73-APC(eBioScience)，CO2恒温培养箱(美国Thermo公司)，高速低温离心机(德国Eppendorf公司)，FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.3 MSCs原代分离用生理盐水将瘢痕疙瘩标本带回实验室，并用生理盐水涮洗3次，采用RIEKSTINA等[6]报道的正常皮肤MSCs的分离方法，将瘢痕疙瘩组织块剪成条索状，用25 g/LⅡ型中性蛋白酶37℃孵育2 h，在无菌条件下用镊子轻轻撕去表皮，留下真皮。再将样本剪成1 mm3大小的组织块，D-Hanks缓冲液洗3次，2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min，加入含有100 mL/L FBS的DMEM培养基终止消化，用吸管反复吹打乳糜状组织块使细胞分离，通过孔径40μm的细胞滤网过滤，滤液离心弃上清，加入含100 mL/L FBS和1%双抗(青霉素和链霉素)的DMEM∶F12(1∶1)培养基重悬细胞沉淀，转移到细胞培养瓶进行培养。
1.4 MSCs的培养及显微镜下的形态观察采用CARLSON等[7]关于小鼠心肌MSCs的培养方法，用含100 mL/L FBS和1%双抗的DMEM∶F12(1∶1)培养基于25 cm2的细胞培养瓶培养细胞，37℃、50 mL/L CO2条件下孵箱，10 d后改为含100 mL/L FBS的低糖DMEM的培养基进行培养，使MSC富集；再改用含10 mL/L FBS的低糖DMEM的培养基培养，在倒置显微镜下观察细胞生长情况，直到长梭形的细胞成为优势细胞；最后用含1 g/L的poly-D-赖氨酸的无血清干细胞培养基(SCM)培养细胞[含低糖DMEM∶Ham’s F12(1∶1)、B27、抗生素、20 ng/mL EGF、10 ng/mL FGF-2、10 ng/mL LIF]，直到细胞完全融合后胰酶消化传代。
1.5 MSCs表面标志的鉴定取第3代贴壁细胞，胰蛋白酶37℃消化2 min，用含100 mL/L FBS的DMEM培养基终止消化，离心、弃上清液，加入PBS制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL，PBS洗涤、离心后加入95μL的PBS重新悬浮细胞，分别滴加5μL的CD29-PerCP、CD44-FITC、CD45-PE和CD73-APC 4种荧光抗体，冰上避光孵育30 min，以1 000 r/min离心5 min，弃去含荧光抗体的PBS，再用PBS洗涤2次，除去未结合的荧光抗体。向细胞中加入500μL预冷的PBS，吹打混匀，转移至流式管中，同时以未被抗体处理的MSCs作为阴性对照，上流式细胞仪进行检测。
1.6观察MSCs生长并绘制生长曲线取第3代细胞，调整细胞密度为1×104个/mL，接种于24孔细胞培养板中培养。分别于培养后第1、2、3、4、5、6、7、8 d采用锥虫蓝染色，计数活细胞并绘制生长曲线。