生防菌株不同生长阶段时发酵液色素与OD650 nm的变化
摘要：真菌GD-2和HZ-31是2株分离于杂草中的具有生防潜力的生防菌株，为进一步研究2株菌株的发酵培养及田间应用技术，进行了生防菌株生长特性研究。通过室内PAS培养基培养，装液量为100 mL/250 mL，培养温度（25±1）℃，培养10 d，观察测定培养过程中发酵液颜色、菌丝干重变化、OD650 nm和pH，并利用聚类分析方法划分生防菌株生长阶段。结果表明，在培养过程中，生防菌株发酵液的颜色、菌丝干重、OD650 nm和pH都会随着培养时间而变化。在相同的培养条件下，来源于不同寄主的生防菌菌株之间在颜色、菌丝干重变化、OD650 nm和pH变化表现出差异。2株生防菌菌株的生长分为3个阶段，1～2 d为适应阶段，3～5 d为对数生长阶段，6～10 d为稳定阶段。生防菌株在培养过程的发酵液色素变化和OD650 nm的变化可作为生防菌株培养的表征性特征。
真菌在生长、产孢、萌发时对营养和环境条件都有其基本的和特殊的需求，了解真菌生长、产孢和萌发的具体特性和要求，对植物真菌病害的研究具有重要意义。不同真菌在不同地区的分布又有所不同，这种差异反映了生防菌对生长环境的选择，表现在其对不同环境利用的生长特性上。在特定的培养条件下，真菌发酵液的颜色、菌丝干重、发酵液吸光度和pH等的变化，都能反映真菌的生长特性。针对筛选出的具有良好生防潜力的2株真菌，研究生长特性，了解适宜培养条件，对进一步研究该菌株的生物防治应用具有重要意义。菌株GD-2和HZ-31是青海省农业有害生物综合治理重点实验室筛选出的对野燕麦具有防除效果的生防菌株[1，2]，本研究对该生防菌株的生长特性进行了研究，有助于了解其培养特性的差异，寻找培养过程的异质性指标，为进一步的生物学研究发酵生产、制剂研制及田间应用等奠定基础。
1材料及方法
1.1试验材料
菌株：供试菌株及来源见表1。
培养基：固体培养基为PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL）；液体培养基为PSA培养基（马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL）。
1.2试验方法
生防菌株培养：将生防菌在PDA平板上培养7 d，打取3个6 mm的菌片，置于盛有100 mL PSA液体培养基的250 mL三角瓶中培养，培养温度为（25±1）℃，摇床转速为110 r/min，每天取3瓶，过滤菌丝，收集发酵液。
观察测定：①观察生防菌株生长过程发酵液颜色的变化。②测定生防菌株生长过程菌丝干重的变化。收集发酵液在5 000 r/min离心15 min，倒掉上清液后菌体用去离子水洗涤，离心，反复3次后放到50℃的烘箱中烘至恒重，在分析天平上准确称重。③测定生防菌株生长过程OD650 nm的变化。将发酵液5 000 r/min离心，取上清液，用UV751GD型分光光度计（上海精科）测定OD650 nm。④测定生防菌株生长过程中pH的变化，分析生防菌株的生长特性。
分析生防菌株的生长阶段，以生防菌株培养时间为分类，以菌株GD-2和HZ-31的菌丝干重、OD650 nm、pH为指标，构建矩阵。以欧氏距离为相关尺度，用类平均法进行聚类分析。
1.3统计分析
采用Eecel软件作图，DPS软件进行数据分析。
2结果与分析
2.1生防菌株生长过程发酵液颜色的变化
2株生防菌株在培养过程颜色变化不同。发酵液颜色会发生阶段性变化，在发酵初期（1～3 d），生防菌菌株GD-2和HZ-31的发酵液颜色与培养基配制时的颜色相同，没有明显的变化。在发酵中期（4～6 d），2株菌株发酵液的颜色发生明显变化，菌株GD-2发酵液在4 d时变为奶黄色，在6 d时颜色加深，转变为黄褐色；而菌株HZ-31发酵液在4 d时则变为淡黄色，在6 d时颜色加深转变为深黄色。在发酵后期（7 d以后），2株生防菌发酵液保持发酵6 d时的颜色，没有明显变化。
2.2生防菌株生长过程中菌丝干重的变化
菌株GD-2和菌株HZ-31培养过程中菌丝干重的变化趋势相差较大，2株菌株的菌丝干重增加量情况存在较大差异（图1）。菌株GD-2菌丝干重增加量最大的时间为5～8 d，8 d时的菌丝干重达到最大值（499.8 mg/100 mL），随后的变化趋于平缓。而菌株HZ-31增加量最大的时间为1～4 d；4 d时的菌丝干重达到最大值，为834.4 mg/100 mL，随后菌丝干重急剧下降。在培养初期菌株HZ-31的生长速度快于GD-2菌株，到培养后期HZ-31菌丝干重明显低于GD-2菌株菌丝干重，2株菌株的菌丝干重的变化出现明显差异，这可能与菌株的生物学特性和对培养基的适应性有关。
2.3生防菌株生长过程中OD650 nm的变化
由吸光度得到的生长曲线可以认为是微生物生长状况的宏观表现。通过测定不同培养时间的OD650 nm，可大体划分微生物生长的不同生长时期，为批量生产提供依据。菌株GD-2和菌株HZ-31发酵过程中发酵液离心上清液的OD650 nm变化如图2。2株菌株发酵过程中变化趋势基本类似，随着发酵进程OD650 nm逐渐增高，在发酵中期出现最高峰值，但是不同的菌株出现峰值的时间不同。GD-2菌株出现2个峰值，在3 d和5 d分别为0.103和0.114，之后OD650 nm变化幅度较大，8 d时达到最低峰（0.027）；而HZ-31变化较缓慢，7 d时达到最低峰（0.027）。
2.4生防菌株生长过程中pH的变化
菌株GD-2和菌株HZ-31发酵过程中pH的变化趋势相差较大（图3）。菌株GD-2培养初期（1～3 d），pH为6.50～6.19，培养中期（4～6 d），pH为5.78～5.87，此时pH上升很快，培养后期（7～10 d），pH为6.02～8.34，变化最快，在培养的2～5 d，pH有所下降。菌株HZ-31从培养初期的6.23逐渐升高为培养后期的9.08～9.04，在4 d时略有波动，从5 d开始，pH的变化趋于平缓。结果表明，2株菌株发酵液的pH从最初的6.2左右逐渐升高8.34和9.04，培养过程中2株菌株pH变化过程差异较大。
2.5生防菌株生长阶段聚类分析
用聚类分析方法对培养时间进行归类。以培养时间为分类，以菌株GD-2和HZ-31的菌丝干重、OD650 nm、pH为指标，构建矩阵，用欧氏距离为相关尺度，以类平均法进行系统聚类，聚类过程见表2。培养时间对菌丝干重、OD650 nm、pH影响见图4。分析结果表明，当λ=81.5时，可将生防菌菌株的生长分为3个阶段，第一个阶段为适应期，培养时间为1～2 d，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化较小，菌株生长处于适应阶段。第二阶段为对数期，培养时间为3～5 d，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化较大，菌株处于对数生长阶段。第三阶段为稳定期，培养时间为6～10 d，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化平缓，菌株生长处于稳定阶段。
3小结与讨论
2株生防菌株在培养过程中，发酵液的颜色、菌丝干重、OD650 nm和pH都会随着培养时间而变化。在相同的培养条件下，来源于不同寄主的2株生防菌株在培养过程中培养液颜色不同，同一菌株生长过程中发酵液颜色会发生阶段性变化，与其生理特性有关，也是菌株培养特征之一。2株菌株培养过程中OD650 nm随培养进程的变化而变化，在发酵期间出现峰值，而且峰值出现的时间不同。OD650 nm为生防菌株生长过程中的生理变化特征之一。生防菌株在培养过程中色素变化和OD650 nm的变化可作为生防菌株培养的表征性特征。这些性状的变化与生防菌的萌发、侵染以及传播等生物学特性的关系有待于进一步的研究。
2株生防菌株培养过程中pH增高，从最初6左右升高到后期的8.34和9.04，2株生防菌株培养程中pH变化差异较大。2株生防菌株在培养过程中，菌丝干重随时间变化而变化，菌丝干重增加量最大的时间分别为2～4 d和5～8 d，而且菌丝干重增加的量存在较大差异。
在培养温度（25±1）℃条件下，HZ-31菌株在培养时间4 d时，菌丝干重最大，为834.4 mg/100 mL，pH为7.71；GD-2菌株在培养到8 d时菌丝干重达到最大值，为499.8 mg/100 mL，pH为7.38，说明2株生防菌株对pH有一定的选择性，表现为均偏好偏碱性的生长条件。
采用PSA液体培养基在（25±1）℃的条件下，来自野燕麦的GD-2菌株的生长分为3个阶段：1～2 d为适应阶段，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化较小；3～5 d为对数生长阶段，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化大；6～10 d为稳定阶段，菌株的菌丝干重、OD650 nm、pH变化平缓。而菌株HZ-31的前期生长速度高于GD-2菌株，对数生长期提前到来，这可能与菌株的生物学特性和对培养基的适应性有关，这与前人研究结果基本一致[3-6]，因此，在进行生防菌的发酵培养过程中，需注意在对数生长阶段的营养供给和培养条件的控制。
研究2株生防菌株的生长特性，对生防菌株的发酵培养具有较好的指导作用，在实际的发酵培养基配方及田间应用方面，还存在着复杂的影响因素，需要进一步研究。
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