实时监测蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的方法
苯丙氨酸作为8种必需氨基酸之一直接参与了生命活动体现者蛋白质的翻译过程,对于生命活动的正常进行发挥着多方面的功能。其在体内的合成由莽草酸循环与芳香族氨基酸合成两部分组成,而每部分均包含了多个反应步骤。苯丙氨酸在体内经苯丙氨酸羟化酶催化作用氧化成酪氨酸,并与酪氨酸一起合成重要的神经递质和激素,被证实在抗抑郁等医学症状方面有很好的效果。另外,苯丙氨酸也为苯丙酮酸(Liu et al.,2015)和其他芳香族化合物的合成,以及多种植物次生代谢生物活性物质,如黄酮类化合物合成提供底物(Dempo et al.,2014)(图1)。因此,苯丙氨酸在医药及保健产品开发中具有重要的地位,但目前研究表明,苯丙氨酸仅可以在植物和一些微生物体内合成,而不能在哺乳动物细胞中发生。同时苯丙氨酸在植物中的含量较低,其合成途径往往伴随着强烈的产物反馈抑制,因此近年来利用微生物细胞工厂合成氨基酸(Brey et al.,2020)成为了一种重要的替代方法。
在早期的研究中,更多的利用大肠杆菌和酵母作为氨基酸类化合物异源生物合成的先驱平台,并取得了系列的成果(Brey et al.,2020)。但氨基酸作为生命体的体现形式和初级代谢的重要底物,在细胞中并没有过多的游离形式可用于生物工程当中的异源产物合成。因此,生物工程研究人员往往通过基因工程改造以及不定向化学诱变等方法期望得到可以进行高产苯丙氨酸合成的菌株。随着全球气候恶化等问题目益突出,碳中性的光合生物合成底盘蓝藻受到了更多的关注。蓝藻作为合成底盘可以通过直接吸收空气中的二氧化碳,产生附加值较高的生物活性物质,且不与农业抢耕地便于集约系统化培养,因此很快发展成为了一种新的绿色“生物智造”平台,得到了极大的关注与发展(Jin et al.,2021)。
苯丙氨酸及其所衍生的大多数化合物往往结构复杂且分子量较大,产物通常无法自由透过细胞的膜壁结构分泌到细胞外或透膜能力较低,因此产物的提取需对细胞进行破壁。而蓝藻由于其细胞壁结构的特殊性,生物酶解以及超声破碎往往难以达到理想的效果,因此蓝藻中苯丙类化合物的提取往往包含了费时费工的细胞离心收集、高强度机械破壁、产物抽提以及利用高效液相色谱进一步进行仪器检测,该传统方法无法进行实时监测。如何在实际工作中对利用基因工程改造或化学诱变的细胞中苯丙氨酸相对含量进行快速界定便成为了摆在研究人员面前的首要问题。
本发明提供了一种利用密码子简并性实时检测蓝藻细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸相对含量的方法,包括以下步骤:
分别构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子和极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体,分别转入蓝藻中,得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株和含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株;
将构建的含极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体转入待检测的蓝藻菌株中,得到改造后的待测蓝藻菌株;
将所述改造后的待测蓝藻菌株和极端偏好密码子的蓝藻工程菌株、含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株分别在含氯霉素、色氨酸和酪氨酸的液体培养基中培养,比较三种菌株的生长曲线,当改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线比含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株的生长曲线有显著性提高时,则说明所述待检测的蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有优势。
优选的,构建含编码苯丙氨酸的极端偏好密码子或极端稀有密码子的氯霉素基因的重组载体的方法,包括以下步骤:
将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTT偏好密码子,人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端偏好密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段,或者将蓝藻氯霉素基因中编码苯丙氨酸的密码子全部替换为TTC稀有密码子,人工合成含强启动子序列、核糖体结合位点、极端稀有密码子的氯霉素基因和基因翻译终止子序列的融合基因片段;
将合成的融合基因片段克隆至骨架载体中,得到重组载体;
将所述重组载体转化至蓝藻宿主中,得到含极端偏好密码子的蓝藻工程菌株或含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株。
在本发明中,所述生长曲线的比较时间优选为培养120~160h,更优选为144h。当所述改造后的待测蓝藻菌株的生长曲线越接近于极端偏好密码子的蓝藻工程菌株,远离含极端稀有密码子的蓝藻工程菌株,说明待检测蓝藻菌株细胞内用于外源生物合成的苯丙氨酸含量方面具有更好的优势。本发明对所述待检测的蓝藻菌株的来源没有特殊限制,可如本发明中通过添加外源氨基酸的方式,或者采用本领域所熟知的物理化学方法诱导获得的潜在高产苯丙氨酸菌株以及基因工程改造的高产苯丙氨酸的蓝藻菌株均可。
相关新闻推荐
1、娄地青霉菌分生孢子萌发的培养基用丙氨酸和精氨酸,τ最长可达33.5小时