发酵培养基有哪些成分组成,和种子培养基的不同
发酵培养基优化,是从事微生物发酵研究经常面临的问题,也是至关重要的一个环节,合理的方法和实验设计是成败的关键。
发酵培养基有哪些成分组成
发酵条件对产物的形成有着非常重要的影响,其中培养基pH、培养温度和通气状况是三类最主要的发酵条件。培养基pH一般指灭菌前的pH,可通过酸碱调节来控制,由于发酵过程中pH会不断改变,所以最好用缓冲溶液来调节;通气状况可用培养基装量和摇床转速来衡量,另外,瓶口布的厚薄也会影响到氧气的传递,为了防止杂菌污染,瓶口布以8层纱布为好。
发酵培养基是指大生产时所用的培养基,由于发酵产物中一般含有较高比例的碳元素,因此培养基中的碳源含量也应该比种子培养基中高,如果产物的含氮量高,还应增加培养基中的氮源比例。但必须注意培养基的渗透压,如果渗透压太高,又会反过来抑制微生物的生长,在这种情况下可考虑用流加的方法逐步加入碳氮源。
培养基组分对发酵起着关键性的影响作用。工业发酵培养基与菌种筛选时所用的培养基不同,一般以经济节约为主要原则,因此常用廉价的农副产品为原料。选择碳源时常用山芋粉、麸支、玉米粉等代替淀粉。而用豆饼粉、黄豆粉等作为氮源。此外,还应考虑所选原料不至于影响下游的分离提取工作。由于这些天然原料的组分复杂,不同批次的原料成分各不相同,在进行发酵前必须进行培养基的优化试验。
发酵培养基中的原料多是大分子物质,微生物一般不能直接吸收,必须通过胞外酶的作用后才能被利用,所以是一些“迟效性”营养物质。而微生物分泌的胞外酶有不少是诱导酶,为了使发酵起始阶段微生物能快速繁殖,可适当在培养基中添加一些速效营养物。
微生物发酵培养基配制注意事项
注意营养物质的浓度比和C/N比
如:糖分含量要适合微生物生长才能良好,糖分过多则抑制微生物生长。一般微生物适宜C/N是25:1(元素C/N的比值,也指培养基中还原糖的含量与粗蛋白质含量的比值)。
营养物质浓度及配比合适
培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑菌或杀菌作用。
另外,培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲,碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值,有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如,在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中,培养基碳氮比为4/l时,菌体大量繁殖,谷氨酸积累少;当培养基碳氮比为3/l时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产过程中,可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。
控制pH条件
培养基的pH必须控制在一定的范围内,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同,一般来讲,细菌与放线菌适于在pH7~7.5范围内生长,酵母菌和霉菌通常在pH4.5~6范围内生长。值得注意的是,在微生物生长繁殖和代谢过程中,由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累,会导致培养基pH发生变化,若不对培养基pH条件进行控制,往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此,为了维持培养基pH的相对恒定,通常在培养基中加入pH缓冲剂,常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4和K2HPO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性,KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时,H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基pH不会过度降低;如果培养基中OH-浓度增加,OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基pH也不会过度升高。
但KH2PO4和K2HPO44缓冲系统只能在一定的pH范围(pH6.4~7.2)内起调节作用。有些微生物,如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节,CaCO3难溶于水,不会使培养基pH过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出CO2,将培养基pH控制在一定范围内。
在培养基中还存在一些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质,也可起到缓冲剂的作用。
原料来源的选择
在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分,特别是在发酵工业中,培养基用量很大,利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如,在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中,常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再如,工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料,而在我国农村,已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外,大量的农副产品或制品,如鼓皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
灭菌处理
要获得微生物纯培养,必须避免杂菌污染,因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言,更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌,一般培养基用1.05kg/cm2,121.3℃条件下维持15~30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中,长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏,如使糖类物质形成氨基糖、焦糖,因此含糖培养基常在0.56kg/cm2,112.6℃15~30min进行灭菌,某些对糖类要求较高的培养基,可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌,再与其他已灭菌的成分混合;长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀,因此,在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时,常需在培养基中加入少量螯合剂,避免培养基中产生沉淀,常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌,然后再混合,避免形成沉淀;高压蒸汽灭菌后,培养基pH会发生改变(一般使pH降低0.2),可根据所培养微生物的要求,在培养基灭菌前后加以调整。
相同点:营养丰富完全,PH相对稳定,都有利于菌体生长繁殖。
不同点:种子培养基的碳源、氮源都是速效或利于利用的,磷酸盐浓度稍高些。发酵培养基碳源、氮源速效与迟效相互搭配,以迟效为主。
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