不同温度、包装方式的草莓中蜡样芽孢杆菌生长曲线（一）
摘要：在对草莓的病源微生物污染调查中发现蜡样芽孢杆菌具有高的检出率。为比较不同温度和不同包装方式的草莓表面蜡样芽孢杆菌数量的变化情况，测定了7℃、15℃、25℃、30℃的温度条件下，采用保鲜盒包装和保鲜膜包装方式的草莓表面蜡样芽孢杆菌生长数据；选用Baranyi Roberts模型为初级模型，拟合不同温度和不同包装方式的草莓中蜡样芽孢杆菌生长曲线，并对模型进行验证。
结果显示，7℃冷藏的蜡样芽孢杆菌均增长缓慢而与包装方式无关；15℃低温贮藏过程中，膜装与盒装延滞期基本相同，但膜装比盒装降低了0.7 lg cfu/g的生长势，说明保鲜膜在此温度下有一定的抑菌作用；在25℃、30℃储藏下两种包装方式的比生长速率和延滞期基本相同，蜡样芽孢杆菌在42 h后分别增长了2.9 lg cfu/g、3.2 lg cfu/g，表明贮藏温度是影响蜡样芽孢杆菌的主要因素。因此在高温条件下蜡样芽孢杆菌会带来潜在的食用安全风险。本研究结果为微生物定量风险评估提供重要信息。
草莓因其风味独特、质地柔软受到广大消费者的喜爱，但其柔软质地和高含糖量也成为微生物繁殖生长的温床。对草莓等即食果蔬安全评价和管控措施多集中在农药残留等方面，但有研究表明，草莓表面的微生物也可成为其食用安全的隐患。蜡状芽胞杆菌是典型的菌体细胞，分布广，对热等致死因子有较强的抵抗力，在农业上部分菌株被作为生态调节剂进行开发和利用。但某些蜡样芽孢杆菌会产生呕吐毒素和多种肠毒素而会引起食物中毒，公认食物中毒类型为呕吐型和腹泻型，典型肠毒素为溶血致死肠毒素BL(Hbl)、非溶血性肠毒素（Nhe）和细胞毒性肠毒素（CytK）等，由于此菌不分解蛋白质，因此食品在感官上无明显变化，易误食发生食物中毒，我国1973-2013年的食物中毒事件中，由蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件占所有食物中毒的构成比12.95%（位居第二）。蜡样芽孢杆菌在我国的产品标准中少有限量，但在多数境外标准中有限量要求，见表1所示。
预测微生物学(predictive microbiology)是一门建立在微生物学、数学、统计学基础上的新兴学科，微生物预测模型的建立为微生物定量风险评估(QMRA)和危害分析关键控制点(HACCP)提供了科学依据，是管理食品安全的重要工具。
表1国内外即食食品中蜡样芽孢杆菌限量要求
本研究结合多年草莓中蜡样芽孢杆菌的检出数据及宏基因组方法对草莓表面微生物群落的调查，通过拟合草莓上市时温度和常见不同包装方式下蜡样芽孢杆菌在草莓中的生长情况，建立各温度下细菌预测模型，并进行模型可靠性验证，旨在推荐合理的草莓贮藏方式，为开展定量风险评估和保障草莓质量安全提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料、试剂
1.1.1材料
草莓，120份样品购于成都大型超市及成都某生产基地，每年度40份样品。蜡样芽孢杆菌（ATCC 11778）。
1.1.2试剂
甘露醇卵黄多黏菌素琼脂(MYP)、缓冲蛋白胨水（BPW）、营养琼脂，购于广东环凯生物科技有限公司；0.75%NaCl，法国梅里埃公司；乙腈（色谱纯）、乙醇（色谱），Fisher Scientific公司；甲酸（色谱纯），TEDIA公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）(suitable for MALDI-TOF-MS)，SIGMA公司。实验用水均为ddH2O。
1.2方法
1.2.1草莓中蜡样芽孢杆菌的计数
草莓蜡样芽孢杆菌污染调查草莓的计数方法参照4789.14食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验法一。确定性验证采用基质辅助解析电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS）方法。
质谱前处理：取菌适量加入70%乙醇水溶液0.75 mL，震荡30 s，常温40 kHz超声10 min，离心1 min弃上清，加入75%乙酸水溶液0.75 mL震荡20 s，加入0.75 mL乙腈震荡均匀，常温40 kHz超声10 min，离心1 min取上清1μL点至靶板，加入1μL CHCA，晾干。
质谱条件：模式Mode liner SARAMIS，能量角75～85，收集范围2000～20000（m/z），每样品100次收集峰叠加，校准品ATCC 8739大肠杆菌。收集质谱图谱导入SARAMIS数据库与数据库中与标准菌株的谱图进行多重比较，获得鉴定相关结果。
1.2.2生长模型的建立
实验设置在7℃、15℃、25℃、30℃条件下设置温度点，在0 h、3h、6h、9 h、18 h、21 h、23.5 h、26.5 h、29 h、31 h、41 h、45 h、52 h、72 h、75 h选择温度点进行蜡样芽孢杆菌计数，将数据导入ComBase数据库的在线软件，选取Baranyi模型作为一级模型进行曲线拟合，方程式：
式中：t为时间，h；Y(t)为t时的菌数，cfu/g；Y0为初始菌数，cfu/g；Y max为最大菌数，cfu/g；μmax为最大比生长速率；λ表示迟滞时间，h；h0表示初始时细胞的生理状态。
1.2.3模型的验证
为了评价建立的动力学模型预测值的可靠性，实验采用准确因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）和均方根误差（Root Mean Square Error，RMSE）对预测值和实测值进行分析检验。RMSE、Af和Bf表达式见公式（4～6）
式中：Nobs表示实测值，Npre表示应用模型得到的预测值，n是观测值个数。