不同条件下裂片石莼水培液的组成成分对耐药弧菌株的抑菌作用（三）
2、结果与讨论
2.1分离弧菌的生化鉴定与耐药性表征
16S rDNA测序结果显示，6株与弧菌属同源性超过99%的菌株，分别为1株副溶血性弧菌(Vp.W1)、1株梅氏弧菌(Vm.R3)、1株锡那罗州弧菌(Vs.W2)和3株溶藻弧菌(Va.W1、Va.S1、Va.M3)(表2)。6株弧菌均为有动力的革兰氏阴性菌，且在无盐环境中不能生长。其中，溶藻弧菌和Vs.W2在高浓度NaCl(10%)环境中可以旺盛生长，而Vp.W1和Vm.R3只能在3%~8%的NaCl环境中生长。Vs.W2和Vm.R3的氧化酶为阴性反应，菌落外围有透明环，具有β-溶血性，溶血性是决定弧菌毒力的重要特征，因此其致病性较强;而其余4株弧菌均无透明溶血环，无致病性，这可能与它们是否存在溶血素基因相关。
表2分离弧菌生化特征及16S rDNA
+表示为阳性反应，–表示为阴性反应，Vp.W1:来源于白虾养殖水的副溶血性弧菌，Vs.W2:来源于对虾养殖水的锡那罗州弧菌，Vm.R3:来源于蛤仔的梅氏弧菌，Va.W1:来源于白虾养殖水的溶藻弧菌，Va.S1:来源于白虾的溶藻弧菌，Va.M3:来源于蛤仔养殖沉积物的溶藻弧菌
分离弧菌对不同抗生素的耐药水平和药敏性见图1。抗生素阿莫西林和氨苄青霉素对6株弧菌的抑菌圈直径均小于13 mm，表明弧菌均对阿莫西林和氨苄青霉素耐药。抗生素哌拉西林对3株溶藻弧菌和Vp.W1的抑菌圈直径小于17 mm，对Vs.W2的抑菌圈直径小于21 mm，耐药率和中介率分别为66.7%和16.7%。另外，抗生素头孢唑林和卡那霉素分别对Va.S1和Va.M3的直径小于18 mm，中介率均为16.7%。抗生素链霉素对Va.S1和Va.M3的直径小于15 mm，抗生素环丙沙星对Va.S1和Va.W1的直径小于21 mm，两种抗生素的中介率均为33.3%。然而，所有弧菌均对其余抗生素头孢他啶、头孢西丁、头孢噻肟、美罗培南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、氯霉素、四环素、复方新诺明敏感。因此，3株溶藻弧菌和Vp.W1具有阿莫西林、氨苄青霉素和哌拉西林三重耐药性，Vs.W2和Vm.R3则有阿莫西林和氨苄青霉素双重耐药性，均为β-内酰胺类抗生素。有研究报道，从贝类和海水样品中分离的弧菌有14.3%至50.0%对至少3种抗生素表现出多重抗生素耐药性，并且对氨苄青霉素和头孢唑林的耐药率均达50%以上，对卡那霉素、甲氧嘧啶和链霉素等也具有中等耐药水平。可见，对多种抗生素耐药的病原菌在海水养殖环境中普遍存在。
图1弧菌对抗生素的抑菌圈直径(a-d)及耐药率(e)
注:Vp.W1:来源于白虾养殖水的副溶血性弧菌，Vs.W2:来源于对虾养殖水的锡那罗州弧菌，Vm.R3:来源于蛤仔的梅氏弧菌，Va.W1:来源于白虾养殖水的溶藻弧菌，Va.S1:来源于白虾的溶藻弧菌，Va.M3:来源于蛤仔养殖沉积物的溶藻弧菌
2.2裂片石莼水培液对弧菌生长的抑制特性
由弧菌24 h生长曲线可知(图2)，弧菌在高浓度(1.0×105 CFU/mL)条件下比相比于低浓度(1.0×103 CFU/mL)提前1~3 h到达峰值，生长更快。初始4 h内，各弧菌处于生长迟缓期，生长量无明显增长;4~12 h为弧菌对数增长期，各弧菌生长量快速增长;12~24 h则进入稳定期，生长量(OD600nm)在小范围内上下浮动，增加或下降0~0.4。
图2弧菌24 h生长曲线
由上述生长曲线可知，各弧菌生长进入稳定期至少需要8 h，且对照组在16~24 h处于增长状态，因此在12 h计算各弧菌抑制率如图3。裂片石莼水培液对各弧菌具有不同的抑制作用，Vp.W1、Vs.W2和Vm.R3在1.25~10 g/L的裂片石莼水培液培养1 d时的抑制率范围为1.32%~39.42%，但在培养3 d时抑制率处于64%~100%，且10 g/L处理组抑制率达80%以上，显著高于第1 d(10.37%~30.06%)(P<0.05)。其中，培养1 d时低密度(2.5 g/L)的水培液对Vs.W2没有抑制作用，对溶藻弧菌抑制率均不超过35%，且培养1 d和3 d的抑制效果差异不显著。
图3不同密度的裂片石莼水培液对弧菌的抑制率
研究表明，大型海藻对弧菌的抑制作用表现出明显的浓度依赖性。随着江蓠提取物浓度的增加，副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(V.harveyi)的抑制率增加。通过先前对副溶血性弧菌的可培养性研究也发现，裂片石莼在高密度(12 g/L)条件下的抑制作用明显高于低密度(3 g/L)。而在本实验中，高密度(10 g/L)的裂片石莼水培液对各弧菌的抑制率在10.46%~100%，低密度(1.25~5 g/L)在1.32%~99.3%，不具有显著的浓度依赖性，这可能和水培液与弧菌共培养的时间有关。事实证明，大型海藻对不同弧菌的抑制作具有时间相关性。等鞭金藻与溶藻弧菌共培养后第2 d开始溶藻弧菌数量迅速下降，第4 d几乎检测不到弧菌。裂片石莼分泌物对溶藻弧菌的抑制作用与水培液的培养时间紧密相关，培养3 d时的抑制率显著高于培养1 d，这可能与活性物质持续释放过程相关。由于大型海藻中含有多种活性物质，因此对细菌有明显的抑制作用。例如裂片石莼二氯甲烷提取物中的萜类化合物作为有效抗菌成分显示出对副溶血性弧菌和溶藻弧菌明显的抑制作用。裂片石莼甲醇提取物中含有脂肪酸等多种具有抗菌活性的化合物，对革兰氏阴性菌具有较大的抑菌圈。虽然裂片石莼水培液中的活性物质浓度低于提取物中的活性物质浓度，但仍显示出一定的抗菌性能。
2.3裂片石莼水培液成分分析
采用GC-MS从不同密度和培养时间下的9组样品中共检测到126种化合物，与对照组相比具有显著差异的化合物有84种(P<0.05)，包括酸(24)、醇酚类(10)、醛酮类(10)、烷烃和芳香烃(8)、杂环(8)、酯(7)、胺(5)、醚(3)、氨基酸(2)、腈(2)、糖苷(2)、糖(2)及糖胺(1)等。与数据库匹配得分在70以上的显著差异物质有25种，主要为醇酚类(24%)和酸类(24%)，且峰面积差异倍数大于50(X=∑(实验组峰面积/对照组峰面积)，X>50)的显著差异物质有10种(图4)，包括p-HPEA、二十碳五烯酸、TBP、MEHP、半乳糖胺、2-乙基己酸、Acetal、甲基-β-D-半乳糖苷、肌醇半乳糖苷和正-辛醇，其中醇酚类占比最大(30%)，其次是酸类(20%)和糖苷类(20%)。峰面积平均差异倍数在40以上的显著差异物质有4种，分别为2，4，6-三溴苯酚、2-(4-羟基苯)乙醇、乙缩醛和邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯。
图4 10 g/L裂片石莼3 d水培液的总离子色谱图
裂片石莼水培液的GC-MS分析显示MEHP、Acetal、p-HPEA和TBP为最显著的差异活性物质。TBP是一种单体溴酚，是溴酚中生产最广泛的物质，据报道对致病菌具有抗菌活性。来自双孢蘑菇的乙酸乙酯提取物中浓度最高的MEHP具有抗菌和抗氧化活性。p-HPEA是一种酚醇类化合物，Acetal是由一分子醛和两分子醇缩合的产物，其含有的醛基可有效增强抗菌活性，大型藻类提取物中含有包括醇类化合物在内的多种生物活性物质具有抗菌潜力。除此之外，二十碳五烯酸和2-乙基己酸是脂肪酸类化合物，在植物和藻类中天然存在，以防御病原体，包括多重耐药细菌铜绿假单胞菌。糖类化合物包括甲基-β-D-半乳糖苷、肌醇半乳糖苷和半乳糖胺，是由糖基形成的含糖衍生物，可治疗多种细菌感染。正-辛醇是一种饱和脂肪醇，具有较强的亲脂性，作为抗菌剂渗透细胞壁和细胞膜以发挥作用。
进一步以筛选种类最多的溶藻弧菌为研究目标，裂片石莼水培液4种优势成分对弧菌的MIC如表3所示。结果表明，TBP对溶藻弧菌的抑菌能力最强，64~128μg/mL即可完全抑制溶藻弧菌的生长，其次是p-HPEA(12 800μg/mL)，其他物质在最高溶解水平下均无抑菌作用。以抗生素作为对照发现，阿莫西林等抗生素在4~128μg/mL时就能够完全抑制弧菌的生长。各活性物质的MICs值是各抗生素MICs值的2~3 200倍，对弧菌的生长具有一定的抑菌作用，且TBP对弧菌的抑制作用与抗生素较为相似。因此，裂片石莼水培液中抑菌活性物质种类丰富，多种物质协同作用更有助于控制病原菌生长。如有研究表明来自巨型猪草的正辛醇和乙酸正辛酯等脂肪醇和酯类化合物对多种病原菌体具有协同抗菌活性。香芹酚和1，8-桉叶素联合使用对单核细胞增生李斯特菌、嗜水气单胞菌和荧光假单胞菌的抑制具有协同作用。Zhang等研究结果也表明Reuterin和儿茶素联合使用对变形链球菌的生长、生物膜的表达具有协同抑制作用。
表3优势差异代谢物和抗生素对溶藻弧菌的MIC(μg/mL)
采用PCA进一步对裂片石莼水培液的差异化合物进行分析(图5)，PC1为52.3%，PC2为16.1%，总贡献率达到68.4%。对照组人工海水位于第二象限，与实验处理组(TA1~TD1、TA3~TD3)分布范围较远，表明裂片石莼水培液中含有丰富的化合物。TA1~TD1(第二、三、四象限)与TA3~TD3(第一、二、四象限)的距离较远，表明随着水培液培养时间的增加，化合物浓度增加。在PC1水平上，TA1~TC1的距离较近，TC1~TD1相距较远，表明在培养1 d的裂片石莼水培液下，低密度(1.25~5 g/L)的水培液对化合物浓度影响不大，高密度(10 g/L)可以增加水培液中化合物的浓度。TA3在第二象限，在PC1水平上与TB3~TD3相距较远，表明在培养3 d的裂片石莼水培液下，提高水培液密度可以增加化合物的浓度。样本TD1、TD3(第四象限)与其他样本(第一、二、三象限)的距离最远，进一步表明10 g/L的水培液对化合物浓度的影响最大。这些结果表明，培养时间和密度对水培液中化合物浓度具有一定的影响。培养相同的时间，在培养密度(1.25~5 g/L)较低时，培养密度对水培液中化合物的浓度影响较小，而提高培养密度(10 g/L)能够增加水培液中化合物的浓度。在10 g/L的培养密度下，第3 d的裂片石莼水培液中化合物的浓度高于第1 d。
图5不同条件下裂片石莼水培液中差异化合物的PCA分析
注:PC1:第一主成分;PC2:第二主成分;A:1.25 g/L;B:2.5 g/L;C:5 g/L;D:10 g/L;T:实验组;Control:对照组;1:第1 d;3:第3 d
不同条件方式下，裂片石莼含有的活性物质具有一定的差异。营养盐、盐度和溶解氧等条件能够影响裂片石莼分泌酚类物质，营养物质对酚类物质的产生具有促进作用，而溶解氧和盐度对其具有消极的影响。海藻次级代谢产物和抗氧化活性随季节发生变化，高氧浓度的强光照可导致藻类产生必需的抗氧化化合物。不同季节褐藻中岩藻黄质的质量分数差异主要是由于光照和温度波动造成的。本研究中，不同密度及持续光照的培养时间也能够影响裂片石莼活性物质的分泌，高密度的裂片石莼水培液随着培养时间的增加可以有效促进活性物质的产生。Singpoonga等研究表明蛹虫草的活性物质腺苷和虫草素的质量分数在培养第1周到第7周显著增加。活性物质的产生是一种持续释放的过程，这与本研究结果一致。综上所述，活体海藻可持续释放多种抑菌活性物质，在控制海水养殖环境病原菌污染方面具有重要意义。
3、结论
本研究从不同养殖场的水产养殖样品中分离出6株耐药弧菌，其中3株溶藻弧菌和Vp.W1具有阿莫西林、氨苄青霉素和哌拉西林三重耐药性，Vs.W2和Vm.R3则有阿莫西林和氨苄青霉素双重耐药性。裂片石莼水培液对各弧菌具有不同的抑制作用，当与弧菌共培养12 h时，各弧菌在10 g/L抑制效果较好;Vp.W1、Vs.W2和Vm.R3在培养3 d(64%~100%)的裂片石莼水培液(1.25~10 g/L)作用下抑制效果显著高于第1 d(1.32%~39.42%);溶藻弧菌在培养1 d和3 d的裂片石莼水培液作用下抑制效果差异不显著，抑制率均不超过35%。此外，培养时间和密度对水培液中的化合物浓度有一定的影响，培养3 d的水培液可以增加化合物的浓度，且高密度(10 g/L)的水培液对化合物浓度影响最大。裂片石莼水培液含有多种化合物，包括酸类、醇酚类、醛酮类、烷烃和芳香烃、杂环、酯类等，以MEHP、Acetal、p-HPEA和TBP较为凸显。
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