茯砖茶中金花菌菌落标准计数方法优化条件【试验】（二）
2.1.2无菌稀释液浓度对金花菌菌落总数的影响
无菌稀释液浓度对金花菌菌落总数的影响见图2。
图2无菌稀释液对金花菌菌落总数的影响
由图2可知，磷酸缓冲溶液对金花菌孢子释放作用不明显，数量仅为（18.0±1.0）×105CFU/g。当稀释液中NaCl浓度为0.85%时，金花菌菌落总数最多，为（35.0±0.8）×105CFU/g。当渗透压过低时，过多的水分进入孢子，会使孢子膨胀或破裂而失活；当渗透压过高时，孢子失水收缩，细胞结构容易被破坏而失活。因此，无菌稀释液以0.85%NaCl溶液为宜。
2.1.3振摇时间对金花菌菌落总数的影响
振摇时间对金花菌菌落总数的影响见图3。
图3振摇时间对金花菌菌落总数的影响
金花菌菌落总数随振摇时间的延长而增加，表明物理振摇对金花菌子囊果破壁也有一定影响。当振摇时间为50 min时，金花菌菌落总数为（36.9±0.8）×105CFU/g；振摇50 min后金花菌菌落总数趋于平缓，因此振摇时间选择50 min。
2.2响应面结果与分析
2.2.1响应面试验设计及结果
以筛子目数、无菌稀释液浓度、振摇时间为自变量，以金花菌菌落总数为响应值，试验设计与结果见表2。零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。
表2响应面设计方案及试验结果
2.2.2模型建立与回归方程分析
采用Design-Expert.V8.0.6对试验数据进行多元线性拟合，得到以金花菌菌落总数为响应值的二次多项回归模型方程：Y=50.42-046A+0.54B+1.78C+0.65AB-0.075AC+2.63BC-8.94A2-10.88B2-14.41C2。对模型方程进行显著性检验，方差分析结果见表3。
表3平板计数法回归方程方差分析表
由表3可知，模型差异性极显著（P＜0.000 1），说明方程与实际情况拟合较好，能够反映金花菌菌落总数与各因素之间的关系；失拟项差异不显著（P＞0.05），说明其他因素对试验影响很小，适用于茯砖茶中金花菌菌落计数方法的优化。
表3中F值的大小可以判断各因素对金花菌菌落总数影响的强弱。各个因素对金花菌菌落总数影响的程度大小的次序为筛子目数＞NaCl浓度＞振摇时间，数学模型的结果表明A、B、C、AB、BC、A2、B2及C2差异性达到极显著水平（P＜0.01），表明各考察因素对金花菌菌落总数的影响具有交互作用，而不是简单的线性关系。可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。其相关系数R2=0.997 9，表明试验所选择的3个变量对响应值的影响已达99.79%，表示该模型条件能够很好地反映实际值。其他影响因素对菌落总数的影响可忽略不计。响应面试验得到的最优处理条件为：筛子目数79.74目、NaCl浓度0.86%、振荡时间50.49 min，模型预测的最佳菌落数为50.49×105CFU/g。
2.2.3各因素之间的响应面结果分析
各因素交互作用对金花菌菌落总数影响的响应面和等高线图见图4。
图4各因素交互作用对金花菌菌落总数影响的响应面和等高线图
响应面三维图中曲面的陡峭程度可以表明自变量对金花菌菌落总数的影响程度，曲面较陡表明影响较大，反之则较小；而等高线图反映了因素间交互作用的强弱大小，椭圆形表示交互作用显著，圆形表示交互作用不显著。结合本研究中的二次回归方程及表3可知，二次项AB、BC具有极显著的交互作用（P＜0.01），即筛子目数与NaCl浓度、NaCl浓度与振摇时间每两个因素间均具有显著的交互作用。由图4可知筛子目数与NaCl浓度、NaCl浓度与振摇时间、筛子目数与振摇时间对菌落总数的影响先升高后降低，响应值呈抛物线形趋势，因此回归方程有极大值。
2.2.4模型的验证试验结果
为了检验响应面方法的可靠性，本研究按照模型得到的金花菌菌落总数最佳计数条件进行试验操作验证，结合试验的可行性，得到最终优化条件为筛子目数80目、稀释液为0.85%NaCl溶液、振摇时间50 min，平行6次试验，得到金花菌菌落总数为（50.75±1.1）×105CFU/g，与模型预测的数值进行比较分析，菌落数的RSD值为1.1%，其RSD值远远小于3%，因此，可以选择以上条件作为茯砖茶中金花菌菌落总数的最佳优化参数。
2.3方法验证
采用上述优化方法与国标方法进行金花菌菌落总数的对比，结果见表4。
表4国标方法和优化方法对不同茯砖茶的计数结果
结果显示，优化方法得到的金花菌菌落总数是国标方法的5倍左右。
3结论
目前关于金花菌菌落计数方法及破壁方法的研究较少，本研究在国标方法的基础上对样品前处理条件进行优化，取样时将整块茶砖撬碎混匀，茶样粉碎过筛80目、稀释液为0.85%NaCl溶液，振摇时间50min（转速为200 r/min），该条件下，优化方法得到的金花菌菌落总数均在107CFU/g以上，相比国标方法提高了5倍左右，优化效果明显，为确定金花菌标准计数方法提供了试验依据。
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