综述葡萄球菌降低发酵肉中生物胺含量的三种机制（二）
2葡萄球菌降胺机制
随着研究的深入，大量研究表明，肉制品中的葡萄球菌具有降低发酵肉制品中生物胺含量的作用，其途径主要有3种：1）葡萄球菌具有生物胺氧化酶，可以将生物胺氧化成醛、氨和H2O2等物质，从而达到降胺的效果；2）葡萄球菌可以产生葡萄球菌素，葡萄球菌素作为一种细菌素具有抑制或杀灭产胺菌的能力，可以从根本上抑制生物胺的产生；3）葡萄球菌可以与其他菌株产生协同作用，更好地发挥降胺效果。因此可以考虑将通过安全性评价且符合发酵剂条件的葡萄球菌作为肉品发酵剂使用。在诸多降胺方法中，添加发酵剂也被认为是最有效的方法之一。图1为发酵肉生物胺来源与形成以及利用葡萄球菌作为发酵剂降解生物胺的途径示意图。
图1发酵肉中生物胺形成与葡萄球菌降解生物胺途径示意图
2.1生物胺氧化酶氧化降胺
已有研究报道，根据辅基类型不同，具有生物胺降解作用的主要有3种酶：胺氧化酶、胺脱氢酶及多铜氧化酶。胺氧化酶具有较强的底物特异性，可以针对性地降低发酵肉中生物胺含量。胺氧化酶最早由Yamada等在黑曲霉中发现，该研究报道，当菌株在以单胺或二胺作为单一氮源的培养基上生长时，在真菌菌丝体中可以形成一种铜胺氧化酶，该酶在磷酸盐缓冲液中可保持其活性，在pH 6.0～7.0、温度35℃时稳定存在，但温度一旦超过40℃其结构就被迅速破坏。之后，从成晶节杆菌KAIT-B-007中分离纯化出具有热稳定性的组胺氧化酶，通过研究其酶学特性，根据原子吸收光谱结果显示，每摩尔该酶含有1个Cu2+，并证明Cu2+对组胺氧化酶的活性有重要影响。
生物胺氧化酶属于氧化还原酶类，是一种能够氧化生物胺的特殊蛋白质。微生物学中根据辅助因子的不同将生物胺氧化酶分为2类：一种是含铜的胺氧化酶，另一种是含黄素的胺氧化酶。根据氧化生物胺氨基数目不同又可以分为单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO）、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和多胺氧化酶（polyamine oxidase，PAO）等。MAO多属于含铜的氧化酶，由于最先发现的MAO以酪胺为底物，因此又叫酪胺氧化酶；DAO主要可对组胺和腐胺产生氧化作用，可用调节它们在组织中的水平；PAO是指所有能氧化多胺类物质的酶，是催化多胺氧化降解的主要酶。PAO不同于MAO与DAO，可以降解多种生物胺，如精胺、亚精胺与腐胺，因此利用PAO来降解发酵肉制品中生物胺的应用前景十分可观。菌株降解1种以上生物胺的能力可能是由于菌株中同时含有几种胺氧化酶，目前已发现葡萄球菌属中的木糖葡萄球菌可产生组胺氧化酶和酪胺氧化酶，肉葡萄球菌可产生组胺氧化酶及MAO等，也证实了这一说法。胺氧化酶主要通过2种方式降解发酵肉中的生物胺：一种是利用MAO直接将生物胺降解成小分子物质，如酪胺等；另一种是肉制品中各种生物胺都有与之相对应的胺氧化酶，生物胺在胺氧化酶与其他酶共同作用下，通过一系列的生化反应转化为相应的盐类，如在腐胺氧化酶与腐胺转氨酶的共同作用下可将腐胺转化为4-氨基丁醛，4-氨基丁醛再在4-氨基丁醛脱氢酶作用下转化为4-氨基丁酸，4-氨基丁酸通过氨转移酶和脱氢酶的作用形成琥珀酸盐，从而达到代谢腐胺的目的。
已有研究发现，发酵食品中含有生物胺氧化酶的微生物通常是乳酸菌属与葡萄球菌属中的某些菌种，如植物乳杆菌、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等。葡萄球菌属中的鼠尾草葡萄球菌菌株不具有胺降解酶活性，该结果也表明菌的胺降解活性不是物种特异性的，而是菌株基因水平特异性的。从意大利香肠中分离出50株具有降解生物胺性状的木糖葡萄球菌，菌株中的S79、S81、S90、S206组胺氧化酶活性尤为显著，可以降低组胺含量，降幅达100%。对不同熏马肠样品中的44株产生物胺氧化酶菌株进行分离与筛选，筛选出具有氧化酶特性和对金黄色葡萄球菌、李斯特菌及大肠杆菌3种致病菌有良好抑制活性的菌株，且耐盐性和耐亚硝酸盐性强，在使用变性梯度凝胶电泳排除重复菌株后，通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法测定其减少生物胺的能力，最终，利用16S rDNA的V6～V8序列进行聚合酶链式反应扩增和测序后，发现菌株中腐生葡萄球菌和木糖葡萄球菌满足要求，可产生物胺氧化酶。通过培养基显色法和氧化酶实验相结合，从发酵香肠中分离产生物胺氧化酶的优势菌，并利用HPLC检测产生物胺氧化酶菌株对生物胺的氧化降解能力，最终获得4株符合发酵菌株标准并产生物胺氧化酶的葡萄球菌；通过16S rDNA分子鉴定，确定上述4株发酵菌株中有3株模仿葡萄球菌和1株表皮葡萄球菌，其中模仿葡萄球菌可显著降低多种生物胺含量。利用含生物胺氧化酶的微生物来防止食品中生物胺的合成和累积并对食品中已存在的生物胺进行降解，对发酵食品的加工工艺以及营养和风味影响甚微，是控制发酵食品中生物胺含量最有效的方法之一。但目前针对生物胺氧化酶的应用主要在于其作为活性物质对动植物生理、病理学方面的治疗功效，很少直接将其运用于食品发酵工艺中，也缺乏对生物胺氧化酶的酶学性质与应用特性的深入研究。
2.2葡萄球菌产生细菌素抑制其他产胺菌
细菌素是一种由细菌产生的抗生代谢产物，多是蛋白或多肽类化合物，主要由某些细菌的核糖体合成。细菌素的抑菌机制主要是为细菌素产生菌提供相对于其他菌株的生存优势。1885年，某些葡萄球菌菌株在固体培养基上能抑制其他葡萄球菌生长这一现象被Babes发现，但由于当时研究条件有限，并未对此作出科学的解释；直到1946年，由葡萄球菌产生的细菌素才正式被定义为葡萄球菌素。并非所有的葡萄球菌菌株都具有产细菌素能力，但有的葡萄球菌又可以产生一种或多种葡萄球菌素。葡萄球菌产细菌素的能力取决于菌株基因组中细菌素基因簇是否完整表达。迄今为止，主要的葡萄球菌素产生菌包括表皮葡萄球菌及金黄色葡萄球菌。大部分葡萄球菌素在抵抗细菌，包括一些病原菌方面具有广谱性。由于葡萄球菌素具有杀死竞争菌并与免疫系统相互作用的能力，认为产葡萄球菌素是葡萄球菌作为益生菌的特性。
发酵肉制品中最常见的生物胺主要是腐胺和尸胺，组胺是最重要且毒性最大的生物胺之一，发酵肉制品中的生物胺氧化酶主要由脱羧酶阳性菌产生，主要有假单胞菌属、肠杆菌属、酵母菌、乳酸菌和肠球菌属等。组胺含量取决于弧菌属、发光杆菌属、克雷伯氏菌属和莫尔甘内拉氏菌属微生物，酪胺主要与肉毒杆菌、肠球菌和弯曲乳杆菌有关，而腐胺和尸胺主要与肠球菌有关。这些微生物可能存在于原料和环境中，对生物胺的产生起着关键作用。研究不同碳源对传统酸肉菌群结构与生物胺含量的影响，发现腐胺和尸胺主要由肠杆菌中的阴沟肠杆菌、沙雷氏菌产生，酪胺的生成主要与肠球菌有关。从314株菌株中筛选出不具有产生物胺能力的木糖葡萄球菌0538，发现其不仅具有降解组胺的能力，而且在体外具有细菌素抑菌活性，可以抑制地衣芽孢杆菌（一种产胺菌）的活性，且其在含有0.5 mmol/L组胺和0.5 mmol/L酪胺的磷酸盐缓冲液中，24 h可以降解38.0%组胺和4.4%酪胺。表皮葡萄球菌素NI01在一定浓度范围内对金黄色葡萄球菌、肠球菌。等具有强大的抗菌活性，通过抑制产胺菌的生理活性起降胺作用。从葡萄球菌3682中发现的细菌素Hyicin 3682不仅具有广谱抗菌特性，而且在食品中具有潜在的防腐作用，可以延缓食品腐败、减少食源性疾病的发生。目前已有研究表明，产细菌素的乳酸菌可用于防止香肠中病原菌生长，为之后利用葡萄球菌素抑制产胺菌的生长、降低发酵肉中的生物胺含量提供了参考。但目前利用葡萄球菌产生的细菌素来抑制其他产胺菌生长的具体研究还十分有限，需要进一步的探究。
2.3葡萄球菌协助其他菌株降胺
测定鱼露中组胺、腐胺和尸胺含量，并对从样品中分离的细菌胺降解活性进行评价。结果表明，33株细菌分离株中，8株具有降胺能力的菌株被进一步鉴定和评估，其中解淀粉芽孢杆菌FS-05和肉葡萄球菌FS-19对组胺的降解率分别为59.9%和29.1%，中间葡萄球菌FS-20和枯草芽孢杆菌FS-12对腐胺和尸胺的降解率分别可达30.4%和28.9%以上。发现，添加木糖葡萄球菌有助于戊糖片球菌进一步降低萨拉米香肠中生物胺的含量，较以单一戊糖片球菌作为发酵剂，组胺含量多降低14.55%，与不添加发酵剂组相比组胺含量降低32.20%。通过测定发酵香肠中酪胺和色胺含量，进一步证实复合发酵剂降解生物胺效果更佳，通过结合微生物菌落计数结果发现，木糖葡萄球菌主要通过抑制乳酸菌及其他杂菌的繁殖，从而为戊糖片球菌提供了适宜的生存环境，更加有利于其降解生物胺作用。在发酵香肠中使用费氏乳杆菌与腐生葡萄球菌组成的复配发酵剂，对组胺、腐胺、尸胺和酪胺的产生均有明显抑制作用。将植物乳杆菌、木糖葡萄球菌作为发酵剂接种至香肠中，发现部分产生物胺的微生物，如肠杆菌丰度显著降低，直接减少了香肠中生物胺（酪胺、腐胺、尸胺、组胺、2-苯乙胺和色胺）的含量，对硫代巴比妥酸反应物值等指标也有影响，进一步证明木糖葡萄球菌在保证样品安全性的同时，还能促进风味物质的形成，得到高品质的风干香肠。将香肠乳杆菌、肉葡萄球菌和肠膜明串珠菌3种发酵剂以不同的组合方式接种到香肠中，发现香肠乳杆菌和肉葡萄球菌共同发酵香肠后，可以有效抑制色胺、腐胺、尸胺、组胺的生成；添加肠膜明串珠菌和肉葡萄球菌可以降低香肠中苯乙胺和酪胺含量，且这2种组合方式的复合发酵剂降胺效果均优于单独使用肉葡萄球菌作为发酵剂。将木糖葡萄球菌与植物乳杆菌作为发酵剂添加入香肠中，发现单独添加木糖葡萄球菌能降低酪胺、组胺和尸胺含量，降幅分别为21%、25%、22%，而接种混合发酵剂可以彻底降解苯乙胺和色胺以及86%腐胺、82%组胺、63%尸胺和43%酪胺。
3结语
生物胺已经成为肉制品中无法避免的一类风险物质，严格控制肉制品中生物胺的含量对于保障人体健康具有重要意义。控制发酵过程中相关的各种因素是降低生物胺含量的有力保障，利用微生物作为发酵剂来抑制发酵肉中的生物胺是近年来最有效的方法之一。葡萄球菌属中的木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌等作为发酵肉制品中的优势菌种，不仅有利于发酵肉的风味、色泽，而且对人体安全无害，因此成为降解发酵肉中生物胺的首要选择，但是降解过程中胺氧化酶的催化机理以及与生物胺的结合位点仍有待进一步研究。为扩大发酵剂菌株在食品产业的应用前景和技术优势，开发各种新型优良发酵剂以及各种混合发酵剂来全面、高效地降低发酵肉生物胺含量将成为今后的研究热点。目前的研究主要集中于降胺菌株的最佳作用条件及降解效率，忽视了与发酵产品总体环境的协调性；此外，从实验室研发到真正将这些降胺菌株应用于发酵食品生产这一过程的实现也仍需要考虑和探索。同时，目前我国乃至世界各国都缺乏对发酵肉制品中生物胺的详细限量标准，急需科研人员在此方面开展系统研究，制定不同生物胺的限量。同时依据风险评定结果，建立合理的监测限量体系，规范生产管理，降低生物胺含量，提高产品质量和安全性，保障消费者身体健康。