维氏气单胞菌分离与纯化、一步生长曲线、热稳定性及pH稳定性研究（二）
2结果
2.1噬菌体分离与纯化
从发病鲫鱼肠道中获得的分离液经双平板法后在平板上可见有大量噬菌斑产生，图1A可见噬菌斑呈圆形，中间透明，边缘清晰整齐，无晕环，但大小不一，分布不均匀，直径在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在说明肠道分离液中有宿主菌的噬菌体存在。噬菌体经纯化增殖后，梯度稀释，用双层平板法计数，该噬菌体的效价可达3.0×1012PFU/mL，噬菌体命名为SJTJYCA01。
图1噬菌体的噬菌斑(A)和超微形态图(B)
2.2噬菌体的超显微形态
通过电子显微镜观察发现，本试验分离的噬菌体为有尾噬菌体，属于尾病毒目短尾噬菌体科，头部直径在45～60 nm，尾部长在16～26 nm，见图1B。
2.3最适感染复数
噬菌体SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI为0.1时的效价最高(效价值达2.55×109)，说明噬菌体SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最适感染复数为0.1。见表1。
表1噬菌体SJTJYCA01的最适感染复数
2.4一步生长曲线
一步生长曲线的结果见图2，噬菌体SJTJYCA01的潜伏期为20 min，裂解期达40 min，裂解量为裂解期平均噬菌体数(14 458 PFU/mL)/潜伏期平均噬菌体数(255 PFU/mL)=57。
2.5热稳定性
在40℃条件下，噬菌体SJTJYCA01的存活率不随时间的增加而减少；在60℃条件下，噬菌体SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率仅为原噬菌体的3%；在80℃条件下，各个时间段均未见有噬菌体存活。见图3。
图2噬菌体的一步生长曲线
图3噬菌体SJTJYCA01的热稳定性
2.6 pH稳定性
噬菌体SJTJYCA01对强酸强碱均较为敏感，在pH 5～10时较为稳定；噬菌体SJTJYCA01的最适pH 7。见图4。
图4噬菌体SJTJYCA01的pH稳定性
3讨论
近年来，国内外有关维氏气单胞菌病例的报道逐年增多，其流行呈明显上升趋势，并已成为一种危害严重的人—兽—鱼共患病原菌。噬菌体作为一种新兴的生物抑菌剂日渐受到学者们的关注。目前，国内外关于维氏气单胞菌噬菌体的研究鲜有报道，仅可见Taruna等从池水中分离到维氏气单胞菌的噬菌体VTCCBPA5和吕孙建等从中华鳖养殖塘中分离得到的非特异性宽谱噬菌体NTHP01(以嗜水气单胞菌为宿主分离获得)。
本试验以鲫鱼源维氏气单胞菌为宿主菌，从发病鲫鱼的肠道中分离获得噬菌体SJTJYCA01。该噬菌体在宿主菌上可形成圆形、透亮，具有典型烈性噬菌体特征的噬菌斑；参照《病毒分类——国际病毒分类委员会第九次报告》，对噬菌体SJTJYCA01的形态进行观察分析，结果可判定该噬菌体为尾病毒目短尾噬菌体科噬菌体(头径45～60 nm，尾长16～26 nm)，此与Taruna等分离获得的VTCCBPA5同属于短尾噬菌体科(头径56 nm，尾长5 nm)，却有别于吕孙建等分离获得的肌尾噬菌体科噬菌体NTHP01(头径60～145 nm，尾长80～455 nm)。因此，这是鲫鱼源维氏气单胞菌短尾科烈性噬菌体在中国的首次报道。
感染复数是研究噬菌体与宿主之间量化与产出的重要生物学指标，在不同感染复数条件下，噬菌体感染宿主菌后分裂得到的噬菌体子代的数量不同，因此，确定最适感染复数对于噬菌体进一步的应用研究具有重要作用。本试验获得噬菌体SJTJYCA01的最适感染复数为0.1，与王志丽分离的鳖源气单胞菌噬菌体的最适感染复数相同，说明该噬菌体裂解效率较高，少量的噬菌体侵染宿主菌即可产生噬菌体子代；噬菌体感染宿主菌的潜伏期和裂解期的长短及裂解量的大小通常与噬菌体、宿主菌及生长条件有关，从潜伏期可得知噬菌体吸附于细胞并释放出子代噬菌体的最短时间，潜伏期和裂解量则是噬菌体增殖的2个特征性指标。噬菌体SJTJYCA01潜伏期和裂解期分别为20 min、40 min，较噬菌体VTCCBPA5(潜伏期35 min)、泥鳅源气单胞菌的噬菌体pAh1(潜伏期30 min)和鳖源气单胞菌的噬菌体(潜伏期50 min)要短，远小于噬菌体NTHP01(潜伏期150 min)，且同样对宿主菌具有较高的裂解量。
目前，气单胞菌属细菌(包括维氏气单胞菌)能造成多种水生动物发生运动性气单胞菌败血症，该病在浙江、湖南、湖北、江西等地的发病高峰期为每年的6～9月(养殖水温在20～30℃，pH一般呈弱碱或弱酸性)，常常出现急性暴发病，严重时的死亡率可达90%以上。本试验分离获得的噬菌体SJTJYCA01在温度低于40℃时能保持较好的稳定性和活性，并在pH 7附近最为稳定。因此，噬菌体SJTJYCA01能很好的适应水产养殖环境，在水生动物细菌性疾病防控中应用具有极大的可能性。本试验筛选获得的维氏气单胞菌烈性噬菌体，不仅丰富了水产致病菌噬菌体的菌种资源，并将为噬菌体作为生物抑菌剂的开发应用提供科学依据。
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