恒河猴肺中阴沟肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验——摘要、材料和方法
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)在自然界中广泛存在，在人和动物的粪便、水、泥土、植物中都可检出。该菌为条件性致病菌，特定条件下能感染呼吸系统、泌尿系统等多个器官系统，同时也可感染创口，严重时引发败血症等。老年人和抵抗力降低的病人是该菌的易感人群。该菌也可导致儿童脑膜炎、脑梗塞、脑脓肿和脑囊肿等疾病，甚至引起死亡。因此，阴沟肠杆菌已成为引起医院内感染的一种重要的病原菌。另外，阴沟肠杆菌B29是国际上公认的“肥胖细菌”，它是造成肥胖的直接元凶之一。大量研究报道，由于抗生素类药物的不合理使用，使阴沟肠杆菌对多种抗菌药物具有较高的耐药性，阴沟肠杆菌普遍对第一代至第四代头孢类、青霉素类等药物有90%以上的耐药率，这为临床用药的选择带来很大困难。经过多年对恒河猴的饲养观察发现，恒河猴呼吸系统疾病发病率高，严重时可引起死亡。本文首次在恒河猴的肺组织中分离到阴沟肠杆菌，通过药物敏感性试验，确定治疗阴沟肠杆菌的首选药物，为今后的临床治疗工作提供依据。
1、材料和方法
1.1实验动物
普通级雄性恒河猴1只，8岁，体重约7 kg。健康KM小鼠10只，雌性，6～8周龄。恒河猴及KM小鼠均来源于中国医学科学院医学生物学研究所医学灵长类研究中心(恒河猴生产许可证号[SCXK(滇)K2015-0004]，使用许可证号[SYXK(滇)K2015-0006];KM小鼠生产许可证号[SCXK(滇)K2014-0002]，使用许可证号[SYXK(滇)K2014-0007])。实验内容经本单位动物实验伦理审查委员会审查通过(批准号:DWSP201902034)，实验过程按实验动物使用的3R原则给予实验动物人道的关怀。
1.2主要试剂与仪器
SS琼脂、GN增菌液、三糖铁琼脂，ID 32 E生化鉴定试条，药敏纸片。电热恒温培养箱、ATB Expression仪。
图1恒河猴病变
1.3实验方法
1.3.1病例资料
该恒河猴身体健康，由人工饲养，每日喂以基础饲料，自由饮水。每日清洗猴笼，定期消毒。通过日常饲养观察发现该恒河猴表现为呼吸困难，精神沉郁，厌食，活动减少等症状，立即转入治疗室单笼饲养及治疗，静脉输液青霉素(80万单位/次)3 d后病情好转，停药观察，该猴精神及饮食情况并未完全恢复。在治疗室内隔离观察20 d后放回大笼饲养，于放回大笼第2天死亡。尸检外观可见腹部鼓气(见图1A)，解剖心脏、肝、脾、胰腺、肾、肾上腺、膀胱未见异常，胃、肠管内充气(见图1B)，部分肠道呈出血性炎性变化，双肺下呈充血、出血，边缘部分肉样肺炎病变(见图1C)。
1.3.2病料采集及培养
解剖柜条件下解剖死亡猴，用无菌手术剪切开肺组织，用灭菌接种环在肉眼病变明显和正常肺组织部位采样，接种于GN增菌液，在恒温培养箱(37℃)内增菌8 h后，接种SS琼脂培养基，将平皿倒置放于37℃恒温培养箱中培养18～24 h后观察结果。
1.3.3细菌分离培养
挑选SS琼脂培养基上典型菌落穿刺接种于三糖铁琼脂鉴别培养基，置于37℃恒温培养箱中培养18～24 h，作进一步的分离培养和产酸产气等培养特征的鉴定。同时挑取单个菌落进行革兰氏染色，镜检。
1.3.4细菌生化鉴定
细菌生化鉴定采用法国生物梅里埃公司ATB细菌鉴定系统及配套ID 32E鉴定卡。按照说明书，在鉴定卡中加入样品后放37℃培养箱内培养，18～24 h内观察生化反应结果。将反应结果编号输入ATB鉴定系统，判定结果。
1.3.5药敏试验
用纸片扩散法，对分离到的细菌进行常用抗菌类药物的敏感性试验。平皿置于37℃培养24 h后取出，观察并测量抑菌圈直径大小(mm)。结果判定按美国CLSI的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准进行。所用8种药敏试纸片如下表。
表1药敏纸片及规格
1.3.6病理检查
取肉眼见明显病变部位，4%甲醛溶液固定后制作病理切片，HE染色，镜检。
1.3.7小鼠致病性试验
用灭菌生理盐水将分离纯培养的细菌稀释，ATB比浊仪调整菌液浓度为4 McF。设立实验组和对照组，实验组6只小鼠，腹腔注射菌液0.5 mL/只，对照组4只小鼠，腹腔注射灭菌生理盐水0.5 mL/只。记录发病及致死情况，解剖死亡小鼠，记录病理变化，无菌条件下采集肺脏组织进行细菌分离培养。