犬奇异变形杆菌及其噬菌体分离鉴定、生长曲线及药敏试验（三）
2.4噬菌斑及噬菌体电镜观察
以分离获得的奇异变形杆菌PM-XNR为宿主菌，通过双层琼脂平板法从污水中分离出1株裂解性噬菌体，命名为vB_PmM_XNR（缩写为XNR）。在双层琼脂平板上可见形状规则、边界清晰、透明的噬菌斑（图1 A）。XNR经负染后电镜显示（图1 B），XNR头部呈二十面体对称，直径约为60±3 nm，具有短尾。
2.5噬菌体的最佳感染复数及一步生长曲线
如表2所示，当MOI=0.01时，噬菌体XNR感染宿主后噬菌体滴度增加了将近104；为XNR的最佳感染复数。
图3 vB_PmM_XNR噬菌斑和电镜图片
表2 vB_PmM_XNR最佳感染复数
当MOI=0.01时噬菌体产出量最高，按0.01的比例绘制一步生长曲线。XNR一步生长曲线如图4所示。XNR感染宿主菌后15 min内（潜伏期）滴度无明显的变化，感染后15～55 min内，噬菌体数量急剧增加，可知XNR爆发时间约为40 min，平均裂解量约为80 PFU·cell-（1裂解量=爆发末期噬菌体效价/感染初期宿主菌浓度）。
图4 vB_PmM_XNR一步生长曲线测定
2.6噬菌体热稳定性、pH稳定性及氯仿敏感性
噬菌体分离自污水中，对环境的适应能力和耐受能力相对较强。温度敏感性实验结果（图5 A）表明，噬菌体vB_PmM_XNR在4℃～42℃之间，活性基本稳定。当温度升高到60℃时，噬菌体vB_PmM_XNR滴度下降100倍左右；达到70℃时，噬菌体全部失活。
从结果（图5 B）可以看出噬菌体vB_PmM_XNR经不同的pH处理1 h后，pH值为2.0和12.0时噬菌体失活；而pH值在6.0～8.0范围内时酸碱度对噬菌体的活性影响不大。上述表明，vB_PmM_XNR具有较好的热稳定性和耐酸碱性，能够满足后续动物体内治疗的需要。
图5噬菌体vB_PmM_XNR的热稳定性和酸碱稳定性测定
由表3可知，氯仿对噬菌体效价无显著影响，说明噬菌体vB_PmM_XNR粒子表面不含有脂类物质，对氯仿不敏感。
表3噬菌体vB_PmM_XNR氯仿敏感性
2.7噬菌体对奇异变形杆菌的裂解作用
从图6中可以看出，XNR对PM-XNR具有较好的裂解作用。XNR作用24 h后，细菌浓度下降3个数量级，由108CFU·mL-1降至105CFU·mL-（1清除效率约为99.9%）；而XNR效价从108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1。PM-XNR浓度随XNR作用时间延长不断降低，XNR效价不断增加，表明噬菌体XNR能够持续有效抑制和清除细菌。
图6噬菌体XNR对奇异变形杆菌的裂解作用
3讨论与结论
近年来，奇异变形杆菌作为人兽共患的病原体，在人与动物中引起的感染频繁发生。特别是能够感染宠物的病原菌，奇异变形杆菌就是其中之一。宠物与人类接触密切，增加了人类感染性疾病患病几率，对人类健康造成一定的威胁，同时也受到了广泛的关注。此外，广谱抗生素的大量使用及滥用，导致临床耐药菌株的产生并且耐药性不断增加，这也为临床治疗带来了较大的挑战，成为严重的医学问题。从大庆市农大动物医院患犬尿液中分离到奇异变形杆菌，该菌株具有溶血活性和产脲酶分解尿素，说明该菌株具有致病性，与宠物出现的感染性结石症状相吻合。
前期研究表明，多数奇异变形杆菌对氨基糖苷类与β-内酰胺类药物敏感。林燕青等对2016～2018年奇异变形杆菌耐药性进行研究，发现奇异变形杆菌对氨苄西林、头孢唑林、复方新诺明、呋喃妥因的耐药率均＞50%，并且氨苄西林/舒巴坦的耐药率从29.8%上升到42.6%；对庆大霉素的耐药率从35.1%降到27.9%。奇异变形杆菌对头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、阿米卡星的耐药率均＜6%。杨睿等作用从腹泻仔猪中分离的15株奇异变形杆菌均有多重耐药性，其中13株含有3种以上的耐药基因。结果表明，腹泻仔猪中分离的奇异变形杆菌含有大量的耐药基因和多重耐药性，可以引起仔猪腹泻症状，导致抗生素在临床治疗时不能发挥。试验对分离的PM-XNR进行药敏试验，发现PM-XNR对大多数药物耐药或不敏感，仅对四代头孢吡肟敏感，超出正常宠物的临床用药，说明分离自犬的奇异变形杆菌耐药性极强，这可能与人类或宠物抗菌药物的使用不当和滥用存在一定联系。同时，有研究表明将动物源和人源奇异变形杆菌菌株进行了毒力基因、表型方面进行比较，未发现不同来源菌株的毒力特征有明显的差异。说明犬源奇异变形杆菌对人类健康存在一定威胁。
噬菌体自发现之初便应用于细菌性疾病的治疗，并取得了良好的治疗效果。由于广谱抗生素的广泛应用，使噬菌体的研究逐渐被人们遗忘。1958年余贺利用噬菌体成功治愈了烧伤病人的绿脓杆菌感染，开创了国内噬菌体治疗的先河。随着抗生素的大量及不正确的使用，导致细菌的耐药性越来越严重，每年因细菌耐药性死亡的人数也在逐渐攀升，据统计到2050年全球每年因细菌耐药性死亡的人数达100万人。噬菌体是一类能够特异性地裂解宿主细菌，不污染环境、无残留、不易产生耐药性的病毒，有望成为抗生素的替代药物。但是，目前临床上针对奇异变形杆菌并没有多少裂解性能较好的噬菌体。
研究针对犬源奇异变形杆菌从污水中成功分离到裂解性噬菌体vB_PmM_XNR，电子显微镜观察vB_PmM_XNR具有二十面体头部结构和可收缩尾部，可判断为肌尾噬菌体科。噬菌体感染复数（MOI）能够表示出感染时噬菌体与细菌的数量比值，也是平均每个细胞感染噬菌体的数量，可应用于制备高浓度噬菌体裂解液。研究中，噬菌体XNR的MOI为0.01。按照噬菌体MOI绘制一步生长曲线，可以计算出潜伏期为15 min，爆发期持续40 min，爆发量为80 PFU·cell-1。这与大多数报道的噬菌体的潜伏期和爆发期结果基本相一致，但是爆发量各报道间差异较大。
吸附过程是噬菌体能够裂解细菌的重要步骤，多数研究表明，吸附过程极易遭受环境（pH、温度、离子等）因素的影响，在应用过程中，噬菌体还要保证在体内（血液、消化液）等极端环境下生存，因此，要求噬菌体对酸碱度、温度等有一定的耐受性。vB_PmM_XNR在4℃至42℃之间滴度稳定，满足噬菌体吸附的最佳温度范围；pH 6.0～8.0范围内活性最好，具有体内应用治疗的潜力。该噬菌体经分离纯化后，效价稳定、较高，在适宜的条件下24 h可使奇异变形杆菌下降3个数量级，说明XNR具有较好的裂解效率，具有潜在应用价值。噬菌体通过宿主菌及自限性繁殖，是噬菌体具有的基本特征。在裂解奇异变形杆菌的同时，XNR效价从108PFU·mL-1增至109PFU·mL-1，说明噬菌体在裂解细胞后能够维持效价稳定，并且有所增加，能够发挥持续的裂解作用。
试验从临床尿石症病犬尿液中分离获得奇异变形杆菌。菌株具有溶血活性，能产生脲酶，具有耐药性，满足感染性结石症的特征。以奇异变形杆菌分离株为宿主菌，分离出一株裂解性噬菌体，命名为vB_PmM_XNR。该噬菌体通过对其生物学特性、体外抗菌试验表明具有治疗和控制奇异变形杆菌引起泌尿系统感染的潜力。