不同盐度和pH环境下嗜水气单胞菌生长曲线变化
嗜水气单胞菌(A.hydrophila)广泛分布在自然界的淡水和海水中，是原发性致病菌，可感染多种水生动物，是引起鱼类出血性败血症的主要病原，是人、兽、鱼共患的致病微生物，在水产学界、兽医学界和医学界受到广泛重视。
嗜水气单胞菌嗜温性、有运动力，为条件致病菌。在14.0~40.5℃水温范围内都可生长，最适温度为28.0~30.0℃。从生产实际接收的病例中分析可推断其主要通过肠道获得感染，不过能否感染还取决于菌体对鱼肠道组织黏附力的强弱和环境的适应性，通常具有高黏附力和适应性的嗜水气单胞菌株才能产生毒性很强的外毒素。
菌外膜蛋白在维持细菌的基本形态、细菌代谢物质的跨膜运输及调节细菌有关物质合成方面起着重要的作用。研究表明细菌外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可激发机体的体液免疫，还可诱导细胞介导的免疫应答。
为了更好地预防该菌对水产的影响，从养殖环境上抑制该菌的生长繁殖，本研究探讨该菌的环境适应性及其外膜蛋白在不同盐度和pH环境下的变化，以期为后续致病机制的研究和蛋白疫苗免疫提供理论基础。
2结果与分析
2.1生长情况
通过生长曲线（图1）可以看出，3~6 h为本菌的对数生长期，6 h后生长趋于平稳达到稳定期。
图1致病性嗜水气单胞菌的生长曲线
2.2对盐的耐受性
由图2可知，在15‰与40‰的盐度下、20‰~30‰盐度环境下该菌增长变化差异不显著，35‰盐度环境下较15‰、20‰、25‰和40‰组增长差异显著，为最适的增长盐度。
图2致病性嗜水气单胞菌对盐度环境的耐受性
不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P＞0.05），下同。
2.3耐酸碱性
由图3可知，pH 2~3的环境中该菌几乎不生长，pH=4时增长较为显著，此时该菌增长缓慢；在碱性环境中（pH=8、9、10）该菌OD值呈下降趋势，pH=6时该菌长势最好，为该菌最适生长的pH环境。
图3致病性嗜水气单胞菌对pH环境的耐受性
2.4对药敏纸片的敏感性
由抗生素的抑菌试验可以发现该菌对喹诺酮类药物最为敏感（表1），如依诺沙星、恩诺沙星、氧氟沙星等；对个别氨基糖苷类抗生素较敏感，如庆大霉素和新霉素；对个别香豆素类抗生素和四环素类药物中度敏感，如新生霉素和多西环素；对磺胺类和氯霉素类抗生素具有耐药性，如磺胺异恶唑和氟苯尼考等。
表1致病性嗜水气单胞菌的耐药性
注：“S”为敏感；“I”为中度敏感；“R”为不敏感。
2.5 HRP⁃黏蛋白测定
选取达到稳定期的菌株，这一时期的菌株增长稳定，各项理化性质达到最佳峰值。通过HRP-黏蛋白浓度与菌体的黏附作用可以得出最佳吸附值。黏蛋白与菌体存在最佳的吸附效果，根据所得的标准曲线回归方程y=1.427 6x－0.021，R2＝0.991 5。依据标准曲线计算出最佳浓度，最佳的结合黏蛋白质量浓度为0.335 9 mg/mL（图4）。
图4菌体与HRP-黏蛋白浓度的黏附效果
2.6蛋白浓度
所得标准曲线的回归方程：y＝2.246 1x+0.040 4，R2＝0.994 1。依据标准曲线将外膜蛋白质量浓度调整到0.1 mg/mL进行SDS-PAGE试验。
2.7蛋白条带
由图5可知，不同pH和盐度环境下，在35~63 ku均有明显的条带变化。将条带切割送生工检测，鉴定蛋白。通过生工质谱检测鉴定，评分最高的蛋白为HSP60（60 ku热休克蛋白）。
图5不同pH（A）和盐度（B）环境下外膜蛋白的变化
2.8 ExPASy的蛋白分析
通过ExPASy-ProtParam tool分析工具进行分析，该蛋白氨基酸数为544，分子质量为57 194.87，理论pI为4.87。其带负电荷的残基总数(Asp+Glu)为80，该蛋白为稳定蛋白，其不稳定指数为29.31，带正电荷的残基总数(Arg+Lys)为62；脂肪指数为98.29，亲水性总平均值(GRAVY)为0.014。通过STRING数据库预测其与相关蛋白的相互关联，图6是证据视图，蛋白质CH60_AERHH在图中显示为groL。
图6 HSP60与其他蛋白的相互作用
3讨论
通过分离鉴定筛选出1株致病性嗜水气单胞菌，在37℃条件下培养3 h达到对数生长期，培养6 h后达到稳定期。由于海水的温度可达28℃、盐度可达25‰以上、pH 7~8，这些条件均适宜致病性嗜水气单胞菌增殖生长，这也是该病可发生在海水鱼中的原因之一；
肠道中的选择性屏障可以调节水和小分子物质的跨膜转运。致病菌侵入肠道内或者机体免疫机能下降都将导致肠道条件致病菌被激活，发生肠源性感染。
热休克蛋白(HSPs)是广泛存在的一类热应激蛋白质。小分子热休克蛋白具有多种功能，包括抗高温高热，作为分子伴侣可以有效地防止蛋白聚集，从而对抗正常的细胞死亡，让细胞数量达到平衡。当细胞受到外部刺激时，许多基因一般并不表达的小分子热休克蛋白开始显著表达，比如高温高热刺激。
研究发现，除了热刺激外还有许多化学、物理刺激可以激活小分子热休克蛋白的表达，例如紫外线、机械损伤、射线、氧化剂、酸等。当细菌侵入机体时，HSP60作为外源性抗原可以通过MHCⅡ类分子使T淋巴细胞发生致敏，同时由于细菌HSP60和动物HSP60有高度同源性，所以会发生自身免疫。
有研究表明，酵母HSP60因某些应激条件出现功能失活或生理缺失则酵母细胞会停止生长，大量的线粒体基质定位蛋白在HSP60的协助下仍能够跨膜转运到线粒体基质中。
热休克蛋白提高了细胞的抗应激和耐受能力，它可以帮助变性、不可溶的凝聚蛋白重新恢复天然构象。热休克蛋白参与不同的生物和免疫反应，在很多免疫治疗中可能都起到重要的作用。后期将通过对嗜水气单胞菌外膜蛋白HSP60的自身免疫作用及以HSP60为基础的自身免疫方法的研究，为水产通过增强自身免疫抵抗病原菌的侵袭提供了坚实的基础。
本研究为大黄鱼致病性嗜水气单胞菌防治提供一定依据，为可持续健康养殖提供新思路，同时为开发疫苗免疫增强鱼体自身免疫提供理论基础。
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