顺-6-十八碳烯酸在制备抗真菌药物之真菌生长曲线的测定
近年来，随着癌症患者、器官移植接受者、老年患者等免疫功能低下人群的不断增加，侵袭性真菌感染(Invasive Fungal Infections，IFIs)的发病率和死亡率日渐攀升。侵袭性念珠菌感染(Invasive Candidiasis，IC)在IFIs中占主要地位，其死亡率粗略估计已高于40％，这其中又以白念珠菌(Candida albicans)为主要感染菌株。白念珠菌除了能以酵母态和菌丝态引起人体浅部和深部真菌感染以外，还能通过形成结构致密的生物被膜附着在内脏表面或生物材料的表面，难以清除，造成反复感染。目前临床上常用的抗真菌药物包括唑类、多烯类、棘白菌素类、丙烯胺类等，随着传统药物的经年使用，临床上真菌耐药的现象日益增多，这也成为真菌感染治疗失败的主要原因之一。除此之外，传统抗真菌药物或多或少存在着毒性大、有效率低、价格昂贵等问题，难以满足人类健康的需求，亟需开发高效、低毒的新型抗真菌药物。
顺-6-十八碳烯酸(Petroselinic Acid，下文中全部使用PeAc代表顺-6-十八碳烯酸)是存在于芫荽、胡萝卜等植物中的不饱和脂肪酸。
已有研究显示：PeAc能调节肠道细菌菌群(Genes.2022；13(11):1967.)。PeAc是牙龈卟啉单胞菌的杀菌剂，是植物提取物防治牙周疾病的主要有效成分(Microbiol.2022；13:816047.)。PeAc能抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，包括耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的生物被膜)，PeAc还能抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的产生(Microbiologyspectrum.2022；10(3):e0133022.)。PeAc能减轻肠缺血/再灌注损伤小鼠的肠道损伤并减少细胞凋亡(British journal of anaesthesia.2022；128(3):501-12.)。真菌界(eumycetes)是生物的一界，是一大类高等真核生物，与细菌完全不同，以上报道多为PeAc抗病原细菌的研究报道，而本发明中涉及的PeAc抗病原真菌的研究，目前国内外尚未见有关报道。
单倍体不足效应分析(haploinsufficiency profiling，HIP)是行之有效的发现抗真菌药物靶标的方法之一。文献报道二倍体的真菌在缺失了一个编码药靶的等位基因后基因剂量(gene dose)减半，该药靶基因缺失菌对药物的敏感性大幅度上升，这种现象被称为单倍体不足效应。研究人员可以通过构建基因敲除菌库，利用单倍体不足效应筛选对药物敏感的基因敲除菌，从而鉴定出药靶。2014年Science曾报道利用酿酒酵母基因敲除菌库鉴定出了氟康唑的药靶Erg11p和他莫西芬的药靶Neo1p(Science.2014；344(6180):208-11)。科学家还利用单倍体不足效应明确了Turbinmicin抗真菌的药靶是Sec14p(Science.2020；370(6519):974-8)，F901318抗真菌的药靶是二氢乳酸脱氢酶(DHODH)(Proc Natl Acad Sci U S A.2016；113(45):12809-14)，化合物G884、G365抗真菌的药靶是Gwt1p(ACS Infect Dis.2015；1(1):59-72)等。
真菌生长曲线的测定
白念珠菌接种于YPD液体培养基中30℃培养16h。吸取活化好的菌液至1.5ml离心管中，于3000g离心1min，吸弃培养基后用PBS洗一次，离心弃上清，用1ml PBS重悬，稀释后取10μl至血细胞计数板计数。在开始培养前，取未经稀释的原菌液于96孔板第一列A1-C1孔中(三复孔)，200μl/孔，第2-10列各孔分别加入100μl RPMI 1640液体培养基，从第一列开始倍比稀释至第10列，测量各孔OD630，并根据各孔不同的OD630
值(x)及其相对应的菌浓度(y)作图得到标准曲线。随后用RPMI 1640液体培养基稀释并调整菌液浓度至1×106cells/ml。将菌液分成数份，转移至50ml离心管，每管10ml。每管菌液中分别加入不同浓度(2、4、8μg/ml)的待测药物PeAc，随后在加入2μg/ml PeAc的几个管中又分别加入不同浓度(4、16、64μg/ml)的FLC，4、8μg/ml PeAc的几个管中进行同样的操作。最后剩余3管，一管只加8μg/mlPeAc，一管只加64μg/ml FLC，一管不加药。所有含菌液的离心管于30℃恒温震荡培养箱中，以200rpm振荡培养，分别于0、2、4、8和12h时在各组菌液中吸取100μl于96孔板中(取之前涡旋混匀各管菌液)测各孔的OD630，利用标准曲线拟合的方程计算各组不同培养时间节点的菌浓度，并以log10 CFU/ml对时间作曲线。实验结果见下图，PeAc与氟康唑联用抗耐药真菌的量效关系的测定结果示意图。
结果显示，单用氟康唑(64μg/ml)或者单用PeAc(8μg/ml)8h后有显示出一定的抑制白念珠菌生长的作用，12h后抑制作用则迅速减弱，白念珠菌生长情况与对照组接近。当固定PeAc浓度为2μg/ml时，与4、16、64μg/ml氟康唑合用，发现随氟康唑浓度的升高，两药协同对耐药菌的抑制作用也增加，但组内的抑制效果差异并不明显。而随着PeAc浓度的增加，两药合用的抑制耐药菌生长的能力也逐渐加强，尤其是当PeAc浓度达到8μg/ml时，与4、16、64μg/ml氟康唑合用，发现两药合用抑制耐药菌生长效果显著，组内的抑制效果差异明显，尤其是“PeAc 8μg/ml+FLC 64μg/ml”的组合使耐药菌的生长抑制在较低水平。因此，两药合用协同抗真菌的作用与PeAc的量效关系更明显。
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