微生物生长曲线监测系统检测抗生素体外动态抗菌作用的潜力
在革兰氏阴性菌出现耐药性的时代，越来越需要体外数据来支持抗生素治疗的临床证据不足。时间杀灭实验和中空纤维感染模型通常用于预测细菌杀灭和耐药性发展的最佳抗生素方案。尽管体外研究结果的临床相关性尚未完全确定，但这些结果对于指导选择要在体内进一步评估的物质和剂量方案很有价值。然而这些方法是相当劳动密集型的并且对于大量抗生素的评价是不可行的。能够对多种抗生素方案进行高通量筛选的其他方法在寻找有效对抗多重耐药菌株的疗法方面将是有价值的。已经开发了许多用于快速评估抗生素活性的自动化方法。这些方法中的大多数提供了关于实验过程中细菌杀死和生长动态的有限信息。Bioscreen C基于浊度测量已用于研究以连续监测细菌生长。然而这种方法需要高细菌接种量来检测光密度(OD)的变化以及与每毫升菌落形成单位(CFU)的相关性，如活菌计数确定的那样是不确定的。本研究旨在评估oCelloScope微生物动态监测系统检测抗生素体外动态抗菌作用的潜力。将两种大肠杆菌和一种铜绿假单胞菌菌株暴露于环丙沙星、粘菌素、厄他培南或美罗培南，代表具有不同作用机制的三种抗生素类别。将使用oCelloScope获得的数据与Bioscreen C的结果进行比较，并且之前使用相同的设置和在选定时间点通过活菌计数获得的细菌浓度进行了标准时间杀灭实验。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统的应用
细菌生长曲线是通过延时成像和oCelloScope系统的BCA算法分析生成的。首先将抗生素原液装入清除平底96孔微孔板，在37°C下预热约15分钟，然后用起始培养物接种以达到每孔总体积为250μL。在将微孔板放入oCelloScope之前，用高度透明的qPCR膜覆盖微孔板。为了尽量减少温度波动，oCelloScope仪器被放置在Thermo Scientific Heratherm培养箱中，设置为37°C。使用底部搜索选项确定每个孔的最佳焦点。对于每个孔，每15分钟拍摄五张图像，持续24小时，图像之间的距离为4.9μm，扫描长度为180μm。所有实验一式三份进行。来自oCelloScope实验的图像使用生长动力学分析算法进行分析：BCA（以前称为像素直方图求和或PHS）和SESA算法。BCA算法通过首先校正背景强度以产生具有均匀光分布的图像来检测细菌生长，然后计算阈值像素值以将图像像素分为背景像素和对象像素。然后根据对象像素数量的变化计算细菌生长曲线。
结论
近些年已经开发了许多用于快速评估抗生素活性的自动化方法。这些方法中的大多数提供了关于实验过程中细菌杀死和生长动态的有限信息。例如Bioscreen C是基于浊度测量，已用于研究以连续监测细菌生长。然而这种方法需要高细菌接种量来检测光密度(OD)的变化以及与每毫升菌落形成单位(CFU)的相关性，如活菌计数确定的那样，测试得到的数值是不确定的。最近开发的一个系统，oCelloScope基于数字延时显微镜和图像分析，也被提议用于测量实时细菌生长。使用这种方法，每个时间点的图像都使用选定的算法同时处理例如，背景校正吸收（BCA）和表面积的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物动态监测系统用于研究暴露于-内酰胺抗生素和环丙沙星时大肠杆菌的细菌形态，以及暴露于丙酸时青霉菌的细菌形态。oCelloScope微生物动态监测系统具有有效评估抗菌活性的潜力，可用于抗生素的高通量筛选，单独或与其他药物联合使用。研究发现与Bioscreen C相比，oCelloScope微生物动态监测系统提供了关于105至107 CFU/mL范围内的细菌生长动态和形态特征的额外信息。总之oCelloScope微生物动态监测系统非常适合于抗生素体外效果的检测，特别是在需要检测大量方案的情况下。
图1、大肠杆菌DA14781暴露于厄他培南1、2、4和16×MIC，大肠杆菌DA19482暴露于环丙沙星，从oCelloScope(A)、Bioscreen C(B)和标准时间杀灭实验(C)获得的平均细菌生长曲线0.5、1、2和4×MIC和粘菌素0.25、0.5、1、2和8×MIC和铜绿假单胞菌ATCC 27853暴露于粘菌素0.5、1、2和4×MIC和美罗培南1、2、4和16×麦克风。每条线代表不同的抗生素浓度，如图例所示。(C)中的符号代表实验中使用的采样时间，黑色虚线代表检测限为10 CFU/毫升。
图2、从oCelloScope微生物动态监测系统显示示出的细胞形态所获得的图像。大肠杆菌DA14781用厄他培南（A）DA14781，大肠杆菌DA19482和环丙沙星（B）和多粘菌素E（C），和铜绿假单胞菌ATCC 27853与粘菌素（D）和美罗培南（E)在0、2、4和24小时。
图3、从oCelloScope获得的背景校正吸收(BCA)与通过大肠杆菌DA14781（空心方块）和DA19482（实心菱形）、铜绿假单胞菌ATCC 27853（空心圆圈）和空白（灰色填充）的活菌计数获得的细菌浓度之间的一致性三角形）。在添加抗生素后1、4、6和24小时。黑色虚线代表10 CFU/mL的检测限。低于LOD的数据绘制为5 CFU/mL。空白样品的细菌浓度设置为0 CFU/mL。
图4、通过的活菌计数获得从BIOSCREEN C中获得的光密度（OD）和细菌浓度之间相关性，大肠杆菌DA14781（空心方块）和DA19482（实心菱形），铜绿假单胞菌ATCC 27853（空心圆）和空白（灰色填充的三角形），在添加抗生素后1、4、6和24小时。黑色虚线代表10 CFU/mL的检测限。低于LOD的数据绘制为5 CFU/mL。空白样品的细菌浓度设置为0 CFU/mL。
图5、oCelloScope、Bioscreen C和标准时间消杀方法的量化方法、优点和局限性总结。如表1中总结的，标准时间杀死实验可以提供关于实验期间初始细菌杀死的更详细信息。此外，由于工作量较大，时间消散是一种更灵敏的检测耐药性出现的方法。然而与时间消磨方法相比，自动化方法的劳动密集度较低，并且每天的产能要高得多。oCelloScope系统可以提供比Bioscreen C更多的信息，因为它具有较低的LOD，还可以用于在实验过程中视觉检测形态特征。
总结
近些年已经开发了许多用于快速评估抗生素活性的自动化方法。这些方法中的大多数提供了关于实验过程中细菌杀死和生长动态的有限信息。例如Bioscreen C是基于浊度测量，已用于研究以连续监测细菌生长。然而这种方法需要高细菌接种量来检测光密度(OD)的变化以及与每毫升菌落形成单位(CFU)的相关性，如活菌计数确定的那样，测试得到的数值是不确定的。最近开发的一个系统，oCelloScope基于数字延时显微镜和图像分析，也被提议用于测量实时细菌生长。使用这种方法，每个时间点的图像都使用选定的算法同时处理例如，背景校正吸收（BCA）和表面积的分割和提取（SESA）。oCelloScope微生物动态监测系统用于研究暴露于-内酰胺抗生素和环丙沙星时大肠杆菌的细菌形态，以及暴露于丙酸时青霉菌的细菌形态。oCelloScope微生物动态监测系统具有有效评估抗菌活性的潜力，可用于抗生素的高通量筛选，单独或与其他药物联合使用。研究发现与Bioscreen C相比，oCelloScope微生物动态监测系统提供了关于105至107 CFU/mL范围内的细菌生长动态和形态特征的额外信息。总之oCelloScope微生物动态监测系统非常适合于抗生素体外效果的检测，特别是在需要检测大量方案的情况下。