大肠杆菌生长曲线的测定、来源OMVs的分离纯化
大肠杆菌生长曲线的测定：
将-80℃保存的大肠杆菌甘油冻存液，按1︰100的比例接种到5mLLB液体培养基中，37℃、200rpm/min条件下培养使菌液OD600值为0.6左右。配制两瓶100mL无菌的LB培养基，按1︰100的比例将OD600值为0.6左右的种子菌液接种到100mL无菌LB培养基中，其中一瓶不接种，作为阴性对照组。
于37℃、200rpm/min的恒温摇床中培养，分别于培养的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24h取出1mL菌液，在96孔板中每孔加入200μL菌液，每个时间点设置3个复孔，在酶标仪中检测OD600值，制作大肠杆菌的生长曲线。经测定后的大肠杆菌生长曲线如图2所示，分析大肠杆菌的生长曲线后可以得出，0-3h为大肠杆菌延缓期，4-14h为大肠杆菌对数生长期，16-22h为大肠杆菌稳定生长期，22h之后为大肠杆菌衰亡期。选取大肠杆菌处在稳定生长期的初期阶段，进行大肠杆菌来源OMVs的分离纯化。
大肠杆菌来源OMVs的分离纯化：
按1︰100的比例，将100μL大肠杆菌甘油冻存液接种到10mL无菌LB培养基中，于37℃、200rpm/min的恒温摇床中培养8h。取上述250μL大肠杆菌种子液接种到250mL无菌LB培养基中，分别接种2瓶含有250mL无菌LB培养基，于37℃、200rpm/min的恒温摇床中培养16h，使大肠杆菌处于稳定生长期的初期阶段。收集处于稳定生长期初期阶段的大肠杆菌培养液500mL，首先在4℃，15000g条件下离心20min去除大肠细菌后取上清液，然后将收集的上清液过0.45μm滤膜去除杂质后收集上清液，再次将收集的上清液过0.22μm滤膜后收集上清液，最后将上清液经100kD滤膜进行超滤处理，去除蛋白质等大分子杂质，用200μL无菌PBS溶液溶解沉淀物，得到大肠杆菌来源OMVs的浓缩液。分别对大肠杆菌来源OMVs进行透射电镜和粒径分布测定，实验结果如图3所示。透射电镜结果表明大肠杆菌来源OMVs是含有双层脂质膜结构的囊泡，同时粒径检测结果表明大肠杆菌来源OMVs的平均粒径为130.4nm，粒径分布范围为20-200nm。上述实验结果表明采用物理过滤的方法成功获得了大肠杆菌来源OMVs。