摩加夫芽孢杆菌在防治水稻稻瘟病方面的应用进展
水稻是世界上最重要的粮食作物，但水稻的高产、稳产、优质一直受到病虫害的制约。而稻瘟病是一种由子囊真菌稻瘟菌引起的世界性的水稻病害，是全世界稻区危害最严重的水稻病害之一。
由于稻瘟病的危害性与流行性，给水稻的产量带来了巨大的损失，因此有效防治水稻稻瘟病是提高水稻产量的关键。在当今社会主要依靠化学农药与抗性品种选育的方式来防治稻瘟病。近年来利用微生物来解决植物病害受到越来越多的关注。
生物防治通常是指利用活体微生物或者其代谢活性物质防治病原菌、害虫和杂草以及调节植物生长的措施来预防或治疗植物的病害，其具有效果稳定明显、对环境的选择压力较小且不易使靶标病原菌产生抗药性等特点，是一种新型安全高效的植物病害防治方式，可以有效地解决水稻稻瘟病高抗品种和化学农药在生产上的局限性。
其中芽孢杆菌分布广泛、环境耐受力强、可产生多种代谢产物，且芽孢杆菌生防菌剂稳定性及相容性较强，是目前用于植物病害生物防治研究最多的一类生防细菌。芽孢杆菌以其耐热抗逆，环境友好等诸多优点成为近年生物防治研究的热点，目前已经报道的防治农作物病害的芽孢杆菌有很多，比如枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌，但摩加夫芽孢杆菌在生物防治方面的报道还较少。
同时虽然生防芽孢杆菌抗病害的研究已经取得了较多成果，但生防产业化进程仍然任重道远。在产业化进程中，既要攻克生防菌发酵生产的培养基配方以及最适于繁殖的生长条件等产业化生产等关键技术。解决上述问题需要技术所有者和生产单位付出更多的时间和精力，才可能实现生防技术从研究成果向批量生产，乃至于实际应用的产业化进程。
鉴于此，针对上述问题，深入研究，遂有本案产生。
下面提供一种芽孢杆菌MTC-8菌种制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出摩加夫芽孢杆菌在生物防治方面的应用上有不足，生防菌生产的培养基配方以及最适于繁殖的生长条件等产业化生产等关键技术仍有待突破的问题。
菌种材料：摩加夫芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）MTC-8，稻瘟菌菌株Guy11、Guy11-eGFP。
水稻材料：丽江新团黑谷（LTH），台北309（TP309）。
将实验室前期获得的水稻内生菌及附生菌进行分离培养，收集可培养细菌332株，真菌及芽孢杆菌128株。将这些菌与稻瘟菌进行平板对峙试验，先在制作好的CM平板上接种稻瘟病菌菌块，恒温培养4d后，在平板四周距稻瘟菌菌块20mm处接种分离出的细菌，28℃恒温倒置培养，2d后观察并记录有抑菌活性的菌株，筛选拮抗菌株。
经过平板对峙实验筛选水稻内生菌及附生菌中的拮抗菌株，发现有抑制稻瘟病菌生长效果的拮抗菌株5株，根据其拮抗稻瘟病菌的效果，选取其中拮抗活性最强的菌种MTC-8进行后续实施例研究。
在NCBI网站上找到BLAST功能，将拮抗菌的序列上传至网站并用GenBank数据库进行比对搜索，比对结果显示拮抗菌MTC-8的16SrDNA序列与摩加夫芽孢杆菌（Bacillusmojavensis）的16SrDNA序列同源性最高，两者的相似度在99%以上，再利用MEGA5.0软件构建了系统发育进化树。
MTC-8菌液培养时间的筛选
MTC-8生长曲线测定：按2%的接种量将MTC-8种子液加入到100mL灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养，分别取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h的菌液测其吸光度（OD600），绘制生长曲线，以确定菌体数量最多的培养时间。
菌液中的菌体量取决于其培养时间，需要选择菌液中菌落数量最大且稳定，并产生芽孢最多的时期用作微生物菌剂的配制。细菌的整个生长期包括延迟期、对数生长期、生长稳定期及衰亡期，菌株MTC-8的生长曲线如图所示，MTC-8的延迟期较短，12h后开始进入增殖状态并迅速进入对数生长期，在48h时菌落数达到最大，48h~72h时菌落数量进入稳定期，72h后菌落数量显著下降，进入生长衰亡期。菌液培养时间在微生物菌剂的制作中发挥着重要作用，若培养时间过短，菌液中的菌体总数过少，且未能形成芽孢，菌体活性低，菌容易死亡；若培养时间过长，菌体活性降低且容易产生发酵产物。因此，在本实施例中可选择生长稳定期48h~72h为菌液培养时间。
MTC-8芽孢率测定：按2%的接种量将MTC-8种子液加入到100mL灭菌后的玉米粉蛋白胨培养基中，于28℃、180r/min震荡培养48h、60h、72h，备用。取三张洁净的载玻片，选取合适位置分别滴加上述培养时间的菌液，用镊子夹住载玻片于酒精灯外焰烘烤片刻，使菌液干燥并将菌种固定。向载玻片滴加数滴5%孔雀绿染色液覆盖涂菌部位，于酒精灯加热至染液冒蒸汽但并不沸腾并维持10min，加热时注意补充染液，切勿让染液干涸。待其略冷却后，使用无菌水冲洗至无明显染液脱出为止。滴加番红染色液涂菌部位复染约2min，无菌水冲洗至至无明显染液脱出为止。待干燥后油镜观察，菌体呈红色，芽孢呈绿色。每个样品取3个视野计数，在油镜下计数芽孢个数及总体菌数，芽孢生成率=芽孢数/总菌数×100%。
为进一步确定MTC-8菌液培养时间，使用孔雀绿-番红染色法对培养48h、60h、72h的MTC-8菌液进行染色，并对视野中的芽孢率进行统计，实验结果：菌体呈红色，芽孢呈绿色，48h、60h、72h的菌液中均产生了芽孢。对不同时间的芽孢产生率进行统计，72h时芽孢产生率最高，为66.7%，综合上述结果，选取培养时间为72h的菌液制作MTC-8生防菌剂。
实验结果表明，MTC-8微生物菌剂在田间对稻瘟病有良好的防治效果，预防效果要好于治疗效果，其病斑数相较对照组减少了一半以上，和稻瘟灵防效相当。
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