重组口蹄疫病毒鉴定、生长特性测定及灭活疫苗制备（一）
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是侵害猪、牛和羊等重大动物的烈性传染病。该病传播迅速、传染性极强、发病率极高，世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health,WOAH)将其列为必报动物疫病，我国将其列为一类动物传染病之首。FMD的暴发和流行严重影响发病地区的畜牧业生产，阻碍社会经济发展，制约健康养殖，是全球畜牧业生产急需解决的重大动物疫病之一。
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)属小RNA病毒科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)成员。FMDV粒子由结构蛋白VP4、VP2、VP3和VP1各60分子组成的二十面体衣壳与单股正链RNA组成，其中结构蛋白VP4位于衣壳的内部，VP2、VP3和VP1位于衣壳的外部。O型FMDV粒子表面至少含有5个抗原位点：VP2和VP3各有1个抗原位点(位点2和4)，VP1含有3个抗原位点(位点1、3和5)，这些抗原位点是诱导保护性抗体产生的主要免疫原。其中位于VP1蛋白130−160位氨基酸的G-H环是诱导动物产生中和抗体最主要的抗原表位，在疫苗免疫保护应答中发挥着关键性作用。因此，FMDV G-H环一直是表位疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗研究的热门靶点。
我国是FMD流行的国家，其中O型FMD流行最广，也最难防控。目前我国流行的O型FMDV主要分为3个拓扑型：古典中国型(Cathay)、中东-南亚型(Middle East-South Asia,ME-SA)和东南亚型(South-East Asia,SEA)。O型多拓扑型病毒株共同流行加剧了FMDV的变异，导致新变异毒株不断出现，使现用疫苗与流行毒株的抗原匹配性下降或抗原不匹配，容易导致免疫失败而引发新疫情的流行，给我国FMD防控提出了前所未有的挑战。因此，迫切需要筛选高效、广谱的FMD疫苗候选毒株。
为了发展能更好地防控当前流行的O型3个拓扑型FMD流行株，本研究借助FMDV的反向遗传操作技术，在已建立含2个拓扑型(Cathay+SEA)FMDV结构蛋白基因全长克隆基础上，将ME-SA拓扑型疫苗株G-H抗原表位基因替换其对等基因，构建含3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组全长克隆，拯救重组FMDV，研究其作为猪疫苗候选株的潜力。
1材料与方法
1.1质粒、细胞和病毒
FMDV疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓扑型)全长感染性克隆嵌合当前流行毒株O/NXYCh/CHA/2018(SEA拓扑型)VP1基因的全长质粒pOFS/NXVP1和半长质粒pSK-Z123/NXVP1均为中国农业科学院兰州兽医研究所构建保存。表达T7 RNA聚合酶的BSR/T7细胞和BHK-21细胞均为本实验室保存。FMDV O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)均由国家口蹄疫参考实验室分离保存。
1.2主要试剂
琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA片段回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、大肠杆菌(Escherichia coli)JM109感受态细胞、高保真DNA聚合酶、限制性核酸内切酶(BglⅡ、SpeⅠ、NotⅠ、PstⅠ)，宝生物工程(大连)有限公司；转染试剂LipofectamineTM 2000、MEM培养基、2×MEM培养基，Invitrogen公司；RNA提取试剂盒，QIAGEN公司；灭活剂二乙烯亚胺(2-bromoethylamine hydrobromide,BEI)，Sigma-Aldrich公司。
1.3 G-H基因替换重组FMDV全长质粒的构建
以pSK-Z123/NXVP1为骨架，替换FMDV疫苗株O/TUR/5/2009(KP202878.1，ME-SA拓扑型)长约30个氨基酸G-H环基因的半长质粒pSK-Z123/NXVP1/TURG-H，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。pSK-Z123/NXVP1/TURG-H和嵌合全长质粒pOFS/NXVP1经SpeⅠ和BglⅡ双酶切后分别回收约5 400 bp(pSK-Z123/NXVP1/TURG-H)和2个大小均接近3 000 bp(pOFS/NXVP1)的DNA片段，然后用T4 DNA连接酶连接、转化，构建重组全长质粒pOFS/NXVP1/TURG-H。全长质粒用PstⅠ进行酶切鉴定，将符合预期的质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序验证。重组质粒含FMDV的基因组示意见图1A，G-H环氨基酸差异见图1B。
图1重组FMDV构建方案示意图
A：重组FMDV基因组质粒全长示意图.B：重组VP1结构蛋白G-H环氨基酸的比对
1.4重组FMDV的拯救
重组质粒pOFS/NXVP1/TURG-H经NotⅠ内切酶37℃消化3 h后，用DNA片段回收试剂盒回收，具体步骤参照试剂盒说明书。取2μg回收的pOFS/NXVP1/TURG-H线性化DNA片段用LipofectamineTM 2000介导转染至80%−90%BSR/T7细胞，并置于37℃、5%CO2培养。转染4−5 h后，每孔加1 mL的MEM培养基。每隔12 h观察细胞状态，当转染细胞出现明显的致细胞病变效应(cytopathogenic effect,CPE)后，将其反复冻融后的上清液接种BHK-21细胞进行传代，子代病毒用于后续试验。
1.5重组FMDV的鉴定
1.5.1 RT-PCR和序列测定
取转染细胞上清液，用RNA提取试剂盒提取总RNA，通过一步法RT-PCR试剂盒扩增病毒VP1蛋白基因。回收、纯化目标PCR产物后送苏州金唯智生物科技有限公司进行序列测定。PCR扩增和测序引物为VP1-F(5′-AGATAACA CAGGGAAAGCC-3′)和VP1-R(5′-CTGATGGC CTTCACTCCAGT-3′)。
1.5.2间接免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)
将转染细胞培养上清和亲本病毒分别接种70%−80%满单层BHK-21细胞。37℃孵育6 h后细胞用4%多聚甲醛4℃固定20 min，PBS漂洗3次；用Triton X-100室温通透10 min，PBS洗涤3次；加入小鼠抗FMDV 3A单抗(1:200倍稀释)，37℃孵育1 h，PBS洗3次；加入二抗(山羊抗小鼠IgG-FITC稀释比例为1:400)，37℃作用1 h，洗去游离二抗后用荧光显微镜观察结果并保存图片。
1.6重组FMDV噬斑表型鉴定和生长特性测定
将10倍比系列稀释的第6代重组FMDV和亲本病毒各200μL/孔，分别接种培养于6孔板的BHK-21细胞，放在37℃条件下孵育，每10 min轻轻摇动1次，1 h后加入2 mL黄芪胶混合液(1份2×MEM，1份1.2%黄芪胶)。细胞静置培养48 h后，加入固定液(甲醇:丙酮=1:1，体积比)固定30 min，经0.1%结晶紫37℃染色2 h后进行噬斑计数和噬斑直径测量，并计算病毒噬斑形成单位(PFU/mL)。
将第6代重组FMDV和亲本病毒的病毒滴度稀释至5×106 PFU/mL，分别接种BHK-21细胞置于37℃孵育1 h。弃去未结合病毒液，补加5 mL MEM培养液继续培养。每隔4 h收取样品至16 h，冻融样品后通过噬斑形成单位测定不同时间点的病毒滴度(PFU/mL)并评价其一步生长特性。
1.7灭活疫苗的制备
取第6代亲本病毒和重组病毒各100 mL，反复冻融2−3次，4℃、6 000 r/min离心30 min，去除细胞碎片。收集的病毒液分别加入5 mmol BEI于28℃灭活30 h。灭活后的病毒接种BHK-21细胞进行安全性检验，检验合格的病毒抗原按照常规方法纯化、浓缩后，按抗原:佐剂等体积比配制疫苗(146S抗原终浓度为6μg/mL)，疫苗制品置于4−8℃保存备用。
1.8猪的免疫
筛选FMDV结构蛋白/非结构蛋白抗体阴性的3月龄健康仔猪共计12头，随机分为2组，每组6头，分别接种亲本病毒疫苗和重组病毒疫苗，接种剂量为2 mL/头份。免疫28 d后采血，分离血清，−20℃保存备用。
1.9病毒中和试验
取免疫后28 d的免疫血清进行微量病毒中和试验检测针对3个拓扑型的4个谱系FMDV株(O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017和O/NXYCh/CHA/2018)的交叉中和抗体水平。微量病毒中和试验操作如下：免疫血清在96孔板中进行2倍比连续梯度稀释；加入50µL病毒稀释液[滴度为200半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose,TCID50)/0.1 mL]，同时设置病毒回归对照(100 TCID50、10 TCID50、1 TCID50、0.1 TCID50)和细胞对照。待测血清和病毒稀释液混匀后，37℃孵育1 h，加入100µL浓度约为1×106个/mL的BHK-21细胞悬液。培养72 h后观察CPE，按Karber法计算血清中和抗体滴度。