柯萨奇病毒B组4型疫苗候选株筛选与研发
柯萨奇病毒B组4型(Coxsackievirus B4，CVB4)是一种能够引起脑炎、急性弛缓性麻痹和心肌炎等严重疾病的肠道病毒，并且还被认为与Ⅰ型糖尿病密切相关。近年来，国内外CVB4的检出率不断升高，已成为一个重要病原体。其致病机理尚不明确，也没有针对CVB4的抗病毒药物和疫苗上市。本研究对CVB4代表株的基因型、全基因组序列、一步生长曲线、遗传稳定性和乳鼠致病性等因素进行初步研究，筛选出一株CVB4的疫苗候选株，并对其免疫原性进行评价，为CVB4的防控提供参考和CVB4的疫苗研发提供实验数据。
方法
1.对课题组前期分离到的28株CVB4分离株使用Vero细胞进行传代适应培养。
2.提取CVB4分离株的病毒RNA，并对VP1序列进行测序，根据VP1序列进行基因分型，并对能在Vero细胞上适应的4株CVB4分离株进行全基因组序列分析。
3.对Vero细胞适应株(136、138、140和141)进行蚀斑纯化，并将毒株传代至第五代，使用微量细胞病变法测定滴度，选择滴度较高的CVB4毒株进行后续实验。
4.将毒株传代至第15代，对P1、P5、P10和P15代病毒进行全基因组测序，分析毒株的遗传稳定性。
5.选择P5代的毒株，使用CVB4分离株进行乳鼠致病性实验，选择3.5、4.5和5.5lgCCID50三个剂量进行乳鼠攻毒实验，并根据乳鼠的临床评分、病理变化、免疫组化和病毒载量结果，探究毒株致病性。
6.选择滴度高且遗传稳定性较好的140毒株，测定病毒株的一步生长曲线，制备灭活疫苗，使用BALB/c小鼠评估其免疫原性。并检测血清交叉保护能力和母传抗体的保护性。
结果
1.本研究分离到的28株CVB4分离株均位于D基因型中，是中国流行基因型。获得4株在Vero细胞上适应良好的CVB4分离株，4株能在Vero细胞上适应的CVB4分离株的全基因组序列和中国流行株0316的核苷酸和氨基酸同源性为92.83%～93.42%和98.26%～98.53%;和其他中国流行株的核苷酸和氨基酸同源性为80.87%～81.53%和96.52%～97.11%;和其他国外流行株的核苷酸和氨基酸同源性为80.65%～93.38%和95.92%～97.57%。
2.对4株CVB4毒株蚀斑纯化后传代至第5代，测定滴度，140和141毒株的滴度达到7.25lgCCID50/mL，136和138毒株滴度为6.25lgCCID50/mL。
3.140毒株相比于141毒株具有更好的遗传稳定性，突变位点较少且VP1区段没有发生突变。
4.140和141毒株均引起脑部、肝脏和肺部严重的病理改变，免疫组化结果表明这些组织中有明显的抗原分布，并且脑部和肝脏的病毒载量高于其他组织，肺部的病毒载量也处在较高水平。5.51gCCID50剂量的141毒株实验组中小肠、胰腺和心脏出现明显的病理变化，小肠、胰腺和心脏组织可见抗原分布。
5.一步生长曲线结果显示，MOI=1时，140毒株病毒拷贝数在3～18小时内快速增加;在18～24小时，病毒拷贝数缓慢增加;在24～30小时出现平台期。
6.140毒株制备灭活疫苗，20μg组在3免后21天的中和抗体效价达到1:2048，该疫苗诱导的中和抗体对136、138、141和A155毒株具有较好的交叉保护作用，诱导的母传抗体可以保护乳鼠在致死剂量攻毒下全部存活，未见明显症状。
结论
1.本研究中得到4株Vero细胞上适应较佳的CVB4分离株，4株分离株位于基因型D，是中国大陆流行基因型。
2.CVB4毒株对脑部、肝脏和肺部具有较强的组织嗜性。
3.本研究成功筛选到一株滴度高、遗传稳定性好且免疫原性较好的CVB4疫苗候选株140毒株。
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