甘露聚糖对S.cerevisiae酵母菌株生长及抗氧化活性的影响（一）
葡萄酒酿造是以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)主导的一系列复杂的微生物代谢和生物转化过程，其细胞活力对发酵酒样中代谢产物的形成具有重要影响[1]。S.cerevisiae生命周期较短，快速衰老会导致发酵不彻底，挥发性化合物的合成和分泌能力大大降低，从而严重影响葡萄酒的香气与感官品质[2]。氧化应激是导致细胞损伤、衰老和死亡的主要原因之一[3]。S.cerevisiae具有一定的氧化应激反应能力，可以通过多种途径保护自身免受各种胁迫，如通过抗氧化酶的水平，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等来体现其对氧化应激的适应性反应；也可以通过产生谷胱甘肽(glutathione，GSH)等非酶类自由基清除剂，保护细胞不被氧化[4-5]。甘露聚糖及其衍生物在体外可以高效清除多种自由基，其中清除超氧阴离子自由基的能力接近维生素C，具有良好的抗氧化活性[6]。RODRIGUEZ-NOGALES等[7]通过添加甘露聚糖和商业酵母制剂，增加了起泡葡萄酒的抗氧化性能。同时，外源性添加甘露聚糖对葡萄酒香气复杂性和风格独特性也具有积极影响。COMUZZO等[8]研究表明，添加低质量浓度的甘露聚糖可以增加葡萄酒中酯类物质含量，而较高质量浓度(500 mg/L)会增加羧酸含量，带给葡萄酒不愉快的气味。李惠琳等[9]比较了4种酵母多糖对霞多丽干白葡萄香气的影响，结果显示甘露聚糖可增加葡萄酒香气的浓郁度和复杂性。总体而言，目前关于酵母甘露聚糖对葡萄酒香气品质提升方面的研究较多，但关于甘露聚糖如何通过影响S.cerevisiae生长及抗氧化性，从而改变酒体香气合成释放的内在机制研究鲜有报道。
本研究以模拟葡萄汁为原料，考察外源性添加甘露聚糖对S.cerevisiae菌株生长及细胞完整性的影响，初步探讨酒精发酵过程中S.cerevisiae菌株抗氧化活性的动态变化规律，以期为进一步研究甘露聚糖对葡萄酒发酵香气的调控机制提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
酿酒酵母Aroma White，意大利Enartis公司；甘露聚糖MP 60，安琪酵母股份有限公司。
ATP酶、SOD活性测定试剂盒、活性氧(reactive oxygen species,ROS)、GSH、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；纤维二糖、磷酸氢二铵、酒石酸氢钾、柠檬酸、磷酸氢二钾等试剂均为分析纯，天津光复化工研究所。
1.2实验方法
1.2.1模拟葡萄汁的配制
参考祝霞等[10]的方法。葡萄糖200 g/L、纤维二糖0.2 g/L、磷酸氢二铵1.5 g/L、酒石酸氢钾2.5 g/L、L-苹果酸3.0 g/L、柠檬酸0.2 g/L、磷酸氢二钾1.14 g/L、硫酸镁1.23 g/L。
1.2.2甘露聚糖对酿酒酵母菌株生物量和活力的影响
在2 L的模拟葡萄汁(2.5 L棕色罐)中，分别添加100、200、300、400、500 mg/L的甘露聚糖(编号分别为MP1～MP5)，以不添加酵母多糖为对照(CK)。按照推荐用量0.2 g/L接种Aroma White，25℃控温发酵，每隔24 h测定模拟汁中酵母细胞的生物量(OD600)，绘制菌株生长曲线。每个样品设置3组平行，结果取平均值。下同。
在模拟葡萄汁中分别添加100、200、300、400、500 mg/L(MP1～MP5)的甘露聚糖，以不添加酵母多糖为对照(CK)，25℃控温发酵。根据前期预实验结果，自接种开始2、4、7 d分别对应菌株生长的前、中、后期，参照文献[11]酵母活力测定方法，检测3个生长时期酵母菌株活力，分析甘露聚糖对S.cerevisiae细胞活力的影响。
1.2.3酵母细胞抗氧化活性测定
1.2.3.1酵母细胞中ATP酶活性测定
参照符安[12]的方法并做修改，收集酵母细胞，3 500 r/min离心10 min，倾倒上清液，用5 mL生理盐水(0.9%)洗涤3次后称重，加入生理盐水，冰水浴超声破碎(4℃，40%功率，开启5 s，停止7 s，共计1 min)，制成0.063 g/mL的匀浆，按照试剂盒说明书进行测定。
1.2.3.2酵母细胞中SOD活性测定
收集酵母细胞，用20倍体积的PBS，1 000 r/min离心10 min洗涤酵母细胞。重复2次后，再加入20倍体积的生理盐水以3 500 r/min离心10 min，冰水浴条件下超声破碎，制成10%的细胞匀浆，再将匀浆稀释5倍，按照试剂盒说明书进行测定。
1.2.3.3酵母细胞中ROS含量测定
取模拟汁，离心10 min收集细胞，用PBS洗涤2次，再用PBS重悬，按照试剂盒说明书加入荧光探针(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)，在最佳波长500 nm，最佳发射波长525 nm处进行荧光检测。
1.2.3.4酵母细胞中MDA含量测定
参照1.2.3.2的方法制成10%的组织匀浆，再将匀浆稀释5倍，按照试剂盒说明书进行测定。
1.2.3.5酵母细胞及模拟汁中GSH含量测定
取模拟汁发酵液10 mL，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定GSH含量。按照1.2.3.2的方法，制成10%的组织匀浆，进行酵母细胞中GSH含量测定。
1.4数据分析
使用Microsoft Excel 2007对试验所得数据进行整理，使用IBM SPSS Statistics 19.0进行多重比较(Duncan法，P<0.05)，用平均值±标准偏差来表示实验结果。
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