微生物生长动态监测系统的应用：研究β-内酰胺类抗生素对丝状化的诱导能力
研究背景：β-内酰胺类抗生素能够改变细菌细胞壁的形状，导致细菌丝状化或球形化。丝状化发生在细胞分裂被阻断但生长继续进行时，形成长度可达其杆状细胞50倍的丝状细菌。丝状形态提供了生存优势，如抑制免疫细胞的吞噬作用、促进在宿主组织内的生存，并减少对某些抗菌剂的敏感性。然而，丝状化并不能直接与抗生素敏感性或抗药性相关联，但在早期AST中是关键知识。β-内酰胺类抗菌药物被广泛用于治疗感染；然而β-内酰胺类耐药性令人担忧的蔓延在全球范围内越来越多地被报道，并代表着一个重大的健康问题。肠杆菌科细菌对青霉素类和头孢菌素最重要的耐药机制是广谱β-内酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人员提出了一种图像分析算法，可量化细菌的长度，从而量化细菌形态的变化。这在检测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单内酰胺类等抗生素时尤为重要。众所周知，β-内酰胺类抗生素可诱导细菌发生形态学变化（如丝状或球形体形成）。因此，快速检测这些变化可能具有重要的临床意义。β-内酰胺类抗生素能够改变细菌细胞壁的形状，导致细菌丝状化或球形化。丝状化发生在细胞分裂被阻断但生长继续进行时，形成长度可达其杆状细胞50倍的丝状细菌。
丝状形态提供了生存优势，如抑制免疫细胞的吞噬作用、促进在宿主组织内的生存，并减少对某些抗菌剂的敏感性。然而，丝状化并不能直接与抗生素敏感性或抗药性相关联，但在早期AST中是关键知识。β-内酰胺类抗菌药物被广泛用于治疗感染；然而β-内酰胺类耐药性令人担忧的蔓延在全球范围内越来越多地被报道，并代表着一个重大的健康问题。
肠杆菌科细菌对青霉素类和头孢菌素最重要的耐药机制是广谱β-内酰胺酶（ESBL）。在本研究中，研究人员提出了一种图像分析算法，可量化细菌的长度，从而量化细菌形态的变化。这在检测青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单内酰胺类等抗生素时尤为重要。众所周知，β-内酰胺类抗生素可诱导细菌发生形态学变化（如丝状或球形体形成）。因此，快速检测这些变化可能具有重要的临床意义。
oCelloScope微生物生长动态监测系统的应用
丹麦BioSense推出的微生物生长动态监测系统（oCelloScope）能自动测量微生物的生长动力学与形态学，同步给出微生物生长早期阶段的生长曲线和形态学动态变化。oCelloScope是一种数字延时显微镜技术，可扫描流体样品，生成一系列图像，使用oCelloScope系统进行时间推移显微成像，每15分钟扫描一次，持续12小时。使用自定义的MATLAB脚本进行图像处理和分析。oCelloScope系统有能通过头孢菌素与β-内酰胺酶抑制剂的组合，快速确定产β-内酰胺酶细菌（如ESBL产菌）的表型。头孢菌素与β-内酰胺酶抑制剂联合产生超广谱β-内酰胺酶。
实验结论
本文提出了一种自动化的基于图像的算法，能够检测抗生素诱导的丝状化。这种方法有助于提高AST的准确性，消除自动系统中的误判。通过快速准确地检测丝状化和抗药性，oCelloScope系统可以作为早期预测抗药性细菌的工具。使用三种不同抗药性和丝状化动力学的E.coli菌株，研究了一种新型图像分析算法，以量化细菌长度和丝状化。研究了12种β-内酰胺抗生素或β-内酰胺酶抑制剂组合对丝状化的诱导能力。丝状化在大约120分钟时达到峰值，平均细胞长度为30微米。
图1、光镜下抗生素诱导大肠杆菌成丝。头孢噻肟(8mg/L)处理后的大肠杆菌ATCC259222的抗生素诱导成丝，光镜下10倍(a)和100倍(b)放大。
图2、哌拉西林对oCelloScope系统获得的大肠杆菌生长和长度的影响。a)采用两种不同的算法对未经处理(点线)和头孢噻肟处理(实线)的大肠杆菌进行细菌生长动力学和成丝的定量测定:生长动力学(蓝色图)是基于分割和提取表面积测量的，细菌长度(绿色图)是基于分割提取的平均长度测量的。8 mg/L头孢噻肟处理后，oCelloScope系统分别在(b)60 min、(c)120 min、(d)180 min和(e)240 min时获得大肠杆菌的形态学图像。
图3、β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂联合应用于抗生素诱导产esbl大肠杆菌成丝的早期检测。哌拉西林/他唑巴坦(32/4 mg/L)(a-b)或替卡西林/克拉维酸(32/2 mg/L)(c-d)处理大肠杆菌的生长动力学和平均细菌长度。哌拉西林/他唑巴坦诱导的微丝(长度增加>5μm)可在30 min内检测到，而替卡西林/克拉维酸诱导的微丝缺失可在40 min内检测到。
图4、β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂组合对大肠杆菌生长动力学的影响。对照菌株大肠杆菌、产esbl大肠杆菌和血培养大肠杆菌分别用4种不同浓度的哌拉西林单独(a-c)或补充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林单独(g-i)或补充克拉维酸(j-1)处理。每隔15 min重复测定生长动力学，持续10 h。
图5、β-内酰胺-β-内酰胺酶抑制剂组合对大肠杆菌细菌长度的影响。对照菌株大肠杆菌、产esbl大肠杆菌和血培养大肠杆菌分别用4种不同浓度的哌拉西林单独(a-c)或补充他唑巴坦(d-f)和噻卡西林单独(g-i)或补充克拉维酸(j-1)处理。每15 min重复测量细菌长度，持续10 h。
总结
β-内酰胺类抗生素能够改变细菌细胞壁的形状，如形成丝状或球形细胞。在依靠比色法或浊度法（如Vitek2、Phoenix、MicroScan WalkAway）的系统中，细菌的丝状化可能会被误认为是生长，从而使抗菌药敏感性的早期测定变得复杂。本论文研究的目的是利用三维数码显微成像系统oCelloScope，研究一种量化丝状细菌的自动图像分析算法。利用三种耐药性不同且丝状化动力学不同的大肠杆菌菌株，研究了一种量化细菌长度和细菌丝状化的新型图像分析算法。共分析了12种β-内酰胺类抗生素或β-内酰胺酶抑制剂组合诱导菌丝生长的能力。丝状化在大约120分钟时达到顶峰，细胞平均长度为30μm。自动图像分析算法显示了快速检测和量化大肠杆菌中β-内酰胺诱导的丝状化的明显能力。这种快速测定β-内酰胺介导的形态学改变的方法可促进未来快速、准确AST系统的开发，进而实现早期靶向抗菌治疗。因此快速检测β-内酰胺介导的形态学变化可能具有重要的临床意义。