银杏内生细菌JX-3最佳生长条件与影响因素
植物内生菌是指那些在植物一生中的某个阶段或全部阶段,能够进入植物的组织和器官内部,与植物共同生存,且不会引发植物组织变化的真菌或细菌。但也可能由于植物自身衰老或一些外界条件刺激,内生菌导致植物免疫力下降,进而产生一些病症[1-3]。内生细菌与植物在长期的进化过程中,形成了一种互利共生的关系,而且有助于植物抵抗恶劣环境,提高植物的生存能力[4]。内生细菌与根际细菌相比,其生存能力更强,抵御一些生物胁迫和非生物胁迫的能力也要强,而且有助于植物对难降解物的降解,有助于生物防治[5-6]。除此之外,植物内生细菌在植物体内有稳定的生存空间,较难受外界环境的影响[7-8]。而且有关植物内生细菌在生防、促生以及固氮作用方面进行了大量研究,证明其有利于生物防治[9-13]。植物内生细菌内有很多植物病原菌的拮抗菌株,而且不同植物种类不同[14-18]。
菌株的生长受许多因素影响,如培养基的pH、温度、接种量和种龄等。为了提高其生长速度,缩短培养时间,本试验选取培养时间、温度、pH和接种量进行单因素试验来确定菌株的最佳生长条件,再由单因素试验结果选择3个影响较大的因素进行正交试验,根据正交试验结果获得更优化的生长条件,从而通过最优的条件培养,获得JX-3菌株的最大生长量。
1材料和方法
1.1材料
供试菌株为银杏内生细菌JX-3。将银杏叶外表面清洗消毒、磨碎,然后涂布于NA固体培养基上,进而挑选单菌落,将其命名为JX-3。
NA培养基为胰蛋白胨5 g,酵母提取物1 g,蔗糖10 g,牛肉膏3 g,蒸馏水1 000 mL,自然pH,121℃高压蒸汽灭菌20 min。
1.2方法
1.2.1制备种子液将活化好的JX-3菌液吸取2 mL加到装有100 mL的NA培养基的250 mL三角瓶中,于37℃,220 r/min振荡培养至对数期,即为JX-3的种子液(OD560值在0.4~0.8即可)。
1.2.2氯化铝反应用移液枪吸取JX-3种子液50μL点在无菌滤纸上,再对着该点喷洒少量2%的AlCl3乙醇溶液,吹风机吹干后置于紫外灯下观察。
1.2.3单因素试验按照接种量、培养基的pH、温度和培养时间4个条件对JX-3菌株的生长条件进行优化,在600 nm波长下测定菌液的OD值。
设置5个培养时间,分别为1,2,3,4,5 h,将培养的种子液接种于NA液体生长培养基中,总体积为5 mL/管,然后置于30℃,220 r/min摇床中振动培养,分别测定其吸光度(OD560)。
设置5个温度梯度,分别为40,35,30,25,20℃,接种种子液于NA液体生长培养基中,总体积为5mL/管(4 mL NA液体和1 mL种子液),置于相应温度、220 r/min摇床中振动培养3 h,分别测定其吸光度(OD560)。
设置5个pH值,即6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,将种子液接种于NA液体生长培养基中,总体积为5 mL/管,置于30℃,220 r/min摇床中振动培养3 h,分别测定其吸光度(OD560)。
设置7个接种量,即16%,14%,12%,10%,8%,6%,4%,将培养的种子液接种于NA液体生长培养基中,总体积为5 mL/管,然后置于30℃,220 r/min摇床中振动培养3 h,分别测定其吸光度(OD560)。
接种量=接入种子的体积/接种后培养液的体积
1.2.4正交试验根据单因素试验结果,设置正交试验表,选择时间、接种量和温度这3个因素分别做3组水平重复。按照设置的细菌JX-3正交试验表接种到试管中,每管总体积为5 mL,于220 r/min对应正交温度下振荡培养相应时间,并分别测定其吸光度(OD560)。
2结果与分析
2.1氯化铝反应结果分析
氯化铝反应发现有黄绿色荧光出现,说明样品中可能含有黄酮类化合物,即JX-3菌株可以产黄酮类化合物。
2.2不同培养时间对JX-3菌体生长的影响
由图1可知,培养时间为4 h时,所获得菌液的OD值最大,为0.843,说明培养时间为4 h时内生菌JX-3的生长效果最好。
2.3不同温度对JX-3菌体生长的影响
由图2可知,当温度为35℃时,所获得菌液的OD值最大,为0.779,说明35℃时内生菌JX-3的生长效果最好。
2.4不同pH值对JX-3菌体生长的影响
从图3可以看出,当pH值为7.0时,所获得菌液的OD值最大,为0.694,说明在pH值7.0时内生菌JX-3的生长效果最好。
2.5不同接种量对JX-3菌体生长的影响
从图4可以看出,接种量为12%时,所获得菌液的OD值最大,为0.635,说明接种量为12%时内生菌JX-3的生长效果最好。
2.6正交优化试验
由表1可知,细菌JX-3的R值排序为:时间>pH>接种量,所以,JX-3的最佳生长条件为:培养时间5 h,pH值7.0,接种量8%。
表1银杏内生细菌JX-3生长的正交试验结果
3讨论
银杏内生细菌对银杏的生长发育有重要的作用,本试验获得了银杏内生细菌JX-3的最优生长温度、pH和接种量。关于内生细菌与植物之间的互利关系还需要更深入的研究,更清楚准确的机制进而解释这种关系。
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