制药废水生化处理过程中硝化菌分离筛选、生长曲线的测定（二）
1.4硝化菌的筛选
将分离得到的硝化菌分别接种到富集培养基中，在30℃、180 r/min的摇床中培养24 h。将初筛选出的硝化菌（OD600约为1.0）按5%的接种量接种于液体培养基中，在30℃，180 r/min摇床中培养。分别在培养0 h、24 h、48 h、72 h后取样检测总氮（TN）、氨氮、硝态氮和亚硝态氮浓度，选取脱氮效果良好的硝化菌。
1.5菌种鉴定
1.5.1形态学鉴定
1.5.2 16 S rDNA分子鉴定
按SK8255（细菌）试剂盒操作说明提取基因组DNA。采用16S rDNA通用引物：27F（5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）；7F（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’）和1540R（5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）进行PCR扩增。硝化菌由上海生工生物完成16S rDNA分子鉴定。将16S rDNA序列结果在核糖体数据库（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）中进行比对，搜索相似性较高的模式硝化菌及其基因序列。
1.6生长曲线的测定
目标菌液（OD600约1.0）按5%体积比接种于液体培养基中，在30℃、180 r/min摇床中培养，定期取样测定菌液在600 nm处吸收值，绘制生长曲线。
2结果与分析
2.1好氧活性污泥微生物结构丰度分析
如图1所示，硫酸新霉素制药废水的好氧活性污泥中优势菌为变形菌门（47.85%），可能存在4种变形菌：β-变形菌（Betaproteobacteria），22.46%；γ-变形菌（Gammaproteobacteria），12.01%；ɑ-变形菌（Alphaproteobacteria），8.84%；δ-变形菌（Deltaproteobacteria），3.97%。
图1活性污泥中的微生物群落分类学系统树状图
2.2硝化细菌的筛选
2.3细菌分离鉴定
2.3.1形态学观察
3株细菌的主要形态学特点见表1。
表1硝化菌的菌落形态特征
2.3.2不同硝化菌对氨氮、亚硝态氮、总氮降解效果
图2不同硝化菌对总氮、氨氮、亚硝态氮和硝态氮的去除效果
2.3.3优势硝化菌A1的染色鉴定
对目标硝化菌A1进行染色，结果显示为革兰氏阴性菌，呈短杆或球杆状，见图3。
图3硝化菌A1在显微镜下观察的形态结果
2.3.4菌种鉴定
对目标硝化菌A1进行16S rDNA测序分析，发现与泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus）DSM 2944的1号染色体完整序列相似性水平达到100%。结合硝化菌的形态学特征及菌种鉴定结果，确定其为泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus），见表2。
表2基于目标硝化菌16S rDNA序列测定结果
2.4硝化菌A1生长曲线测定
由图4可知，在培养初期细菌生长速率缓慢，12 h后进入对数生长期，48 h左右到达稳定期。
图4硝化菌A1的生长曲线
3结论
本实验对硫酸新霉素制药废水处理中的好氧活性污泥的微生物菌群结构采用宏基因组技术进行了解析。研究结果表明，从门水平而言，好氧污泥中细菌类型主要为变形菌门（丰度47.85%）和拟杆菌门（丰度11.77%），其中硝化螺菌属丰度为0.75%；通过宏基应组测序对主要差异物种进行解析，好氧污泥中丰度最高的变形菌门可能存在着4种变形菌属，分别为α-变形菌、丙型变形菌、β-变形菌、δ-变形菌；从污泥样本中分离筛选出3株具有硝化能力的硝化菌，其中硝化菌A1具有较好的硝化能力，经鉴定为泛养副球菌（Paracoccus pantotrophus），与污泥中高丰度菌门结果一致，A1除有明显脱氮效果外，还表现出反硝化功能。该研究发现对硫酸新霉素制药废水处理研究具有重要意义，今后将结合实际对硝化菌脱氮条件进行优化，为制药废水脱氮工程实践应用提供依据及经验。