土霉素菌渣无害化处理：筛选菌株的生长曲线及产蛋白酶条件（一）
土霉素菌渣是龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)发酵生产土霉素过程中产生的酸性固态废弃物，是在土霉素提取过程中，加入草酸等试剂酸化过滤后产生的，因此呈酸性，主要含有土霉素生产发酵培养基成分、生产用菌体和产品分离、提纯所用的试剂以及残留的土霉素等。2008年抗生素菌渣列入《国家危险废物名录》，禁止用作饲料或饲料添加剂。土霉素菌渣含水量高、热值低，在烘干和焚烧过程中需要大量的外部热量和燃料，因此其处置成本较高。我国虽没有明文规定抗生素菌渣不能作为肥料使用，但其存在菌渣处理不完全、制备的有机肥可能含有的抗生素残留或代谢中间产物，在生物体内累积，产生抗药性等潜在的生态风险。如何在环境友好、安全的前提下，合理有效地利用菌渣是目前亟待解决的重要课题。
本研究通过筛选能够耐受土霉素菌渣并能产生蛋白质酶的菌株，旨在利用该菌株对土霉素菌渣进行发酵处理，充分利用菌渣成分，获得可再利用的发酵液，作为培养基成分重新利用于土霉素生产中，在节省资源的同时，达到菌渣的无害化处理目的。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
土霉素菌渣和土霉素菌渣堆肥，均由内蒙古华曙生物科技有限公司提供。
1.1.2试剂与仪器
土霉素标准品(HPLC≥95%)，；蔗糖、赖氨酸、Folin-酚试剂、茚三酮、重铬酸钾等试剂均为国产分析纯。TU-1901紫外分光光度计；TGL-16K高速冷冻离心机；霉菌培养箱MJ-16085-III，；ZHWY2102C立式双层恒温摇床。
1.2方法
1.2.1培养基的配制
5%菌渣培养基：称取干燥的400目土霉素菌渣粉末5 g加到100 mL自来水中混匀，pH值自然，用高压灭菌锅灭菌121℃，20 min，备用。配制5%的菌渣固体培养基需要加入5 g琼脂以确保凝固性。
10%菌渣培养基：称取干燥的400目土霉素菌渣粉末10 g加到100 mL自来水中混匀，pH值自然，用高压灭菌锅灭菌121℃，20 min，备用。
察氏液体培养基：硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、水1 000 mL。121℃，20 min灭菌备用。固体察氏培养基添加2%的琼脂。
1.2.2菌株的筛选
用无菌水浸泡土霉素菌渣堆肥样品，得到的浸出液在察氏培养基平板上进行涂布，30℃下培养，获得菌落。
将察氏培养基上生长出的不同单菌落，分别在5%菌渣固体培养基上划线接种，在30℃条件下培养，分别获得M-1、M-2的单一菌落。
1.2.3筛选菌株的生长曲线
制备孢子悬液：分别选择在察氏培养基上长势良好且孢子旺盛的M-1、M-2菌株，分别刮取孢子，用无菌水制成2.0×106个/mL的M-1和M-2的孢子悬液。
在装有100 mL察氏培养基的250 mL锥形瓶中，分别接入1 mL的M-1、M-2孢子悬液。每种菌做3组平行，每组13瓶。30℃、160 r/min摇床上培养。每隔12 h取出6瓶，5 000 r/min离心10 min，称量菌丝湿重，绘制生长曲线。
1.2.4筛选菌株的酸、碱耐受性
分别配制pH值为2、3、4.5、6.5、7、8的100 mL/250 mL察氏培养基。分别接入1 mL的M-1、M-2的孢子悬液，每个梯度平行做3组，在30℃，160 r/min条件下培养6 d。5 000 r/min离心10 min，称量菌丝湿重，考察菌株的土霉素耐受性。
1.2.5筛选菌株的土霉素耐受性
配制含有土霉素0、200、600、1 000、1 400和1 800 u/mL，pH 3的察氏液体培养基各100 mL，分别加入250 mL锥形瓶中。吸取1 mL的M-1、M-2的孢子悬液接入不同土霉素含量的察氏液体培养基中，在30℃，160 r/min条件下培养6 d。用5 000 r/min离心10 min，获得湿菌丝，称重，分析并比较土霉素对菌体生长的影响，考察其土霉素耐受性。
1.2.6菌株产蛋白酶条件的优化
(1)菌株产蛋白酶活力的测定。以酪氨酸为标准物，Folin-酚试剂为显色剂，在660 nm处测定吸光值，绘制酪氨酸标准曲线，其回归方程式为y=127.22x-1.948 8，R2=0.997 4。
取一支试管，加入1 mL酪蛋白溶液(2%，pH 6.5磷酸盐缓冲液配制)，置入40℃水浴中预热5 min，再加入1 mL 40℃预热5 min的样品溶液，混匀后在40℃水浴中保温10 min。立刻加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸，摇匀，保温20 min。离心，吸取上清液1 mL，加入5 mL的0.5 mol/L碳酸钠溶液，最后加入1 mL Folin-酚试剂，于40℃水浴中显色20 min。在660 nm波长下测吸光度。
酶活定义为在40℃，pH 6.5条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 mg酪氨酸所需的酶量为1个酶活力单位(u)。
(2)菌株产蛋白酶条件的优化。为了优化产酶条件，以蛋白酶活力为依据，在察氏培养基中，对培养温度、pH值和培养时间进行研究。在菌渣培养基中，对菌渣添加量、接种量和装液量等因素进行研究。
1.2.7筛选菌株对土霉素菌渣的转化
(1)菌渣整体质量的变化。在含有100 mL 5%菌渣液体培养基的250 mL锥形瓶中，分别加入8 mL的M-1、M-2的孢子悬液和无菌水，平行3组。在30℃、160 r/min条件下培养7 d。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105℃条件下烘干至恒重，冷却后精确称量其重量。
(2)菌渣蛋白质含量的变化。培养方法同上。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集沉淀物。沉淀物在105℃条件下烘干至恒重，用凯式定氮法测定其蛋白含量。
(3)菌渣的游离氨基酸变化影响。培养方法同上。取出后在5 000 r/min条件下离心10 min，收集上清液，定容至一定体积，并测定其游离氨基酸含量。游离氨基酸的测定，以赖氨酸标准物，茚三酮为显色剂，在565 nm波长处测吸光值，得到回归方程式为y=304.74x+7.299 1，R2=0.999 1。
2结果与分析
2.1菌株的筛选
分离纯化获得两种霉菌，分别命名为M-1和M-2，菌落形态如下图。经初步鉴定M-1为米曲霉、M-2为绿色木霉。
图1筛选菌株菌落形态
2.2筛选菌株的生长曲线
将筛选菌株接种到液体察氏培养基中，培养一定时间后分别取样测定菌丝湿重，以菌丝湿重值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。由图2可见，培养开始24 h后，两种菌株的菌丝重量均急剧上升，此时菌种进入快速增长期。在72 h时，菌株M-1到达增长高点，随后菌丝湿重无明显变化，进入缓慢衰亡期；而菌株M-2在108 h时菌丝湿重达增长高点，随后进入衰亡期。
图2筛选菌株生长曲线
2.3筛选菌株的酸、碱耐受性
由图3可知，M-1和M-2分别在pH 3和pH 6.5表现出最佳的生长量，均呈现出良好的耐酸性。M-1耐酸性好于M-2。两种菌对碱性环境耐受性较差。
图3 pH值对菌体生长的影响
土霉素菌渣的pH在3.35到3.77之间呈酸性。两种霉菌都可以在样品的pH范围内生长，满足了处理土霉素菌渣的必要条件。
2.4筛选菌株的土霉素耐受性
从图4可知，M-1土霉素耐受性好于M-2。土霉素浓度低于1 800 u/mL时，对两种霉菌的影响有限，两株霉菌可以在较高浓度的土霉素环境下均生长良好。菌渣里土霉素残留在416.6 u/mL左右，远低于1 800 u/mL的土霉素浓度，所以两种菌株在处理土霉素菌渣时，不会被土霉素抑制继而影响处理效率。
图4土霉素浓度的变化对菌体生长的影响
2.5菌株产蛋白酶条件的优化
2.5.1培养基初始pH对菌株产蛋白酶能力的影响
向100 mL/250 mL察氏培养基中，分别接入1 mL M-1、M-2孢子悬液，初始pH值分别设定为5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5，平行3组，在30℃，转速为160 r/min条件下培养168 h，分别取样测定酶活，考察pH值变化对产酶活性的影响，结果如图5。
图5初始pH对菌株产酶的影响
培养基初始pH值小于6.0时，菌株M-1和M-2均随着pH值的增大其产蛋白酶活力快速增加，pH值大于7.0时，随着pH值的增大其酶活力快速下降；菌株M-1在pH 6.0时，蛋白酶活力达到最高值，菌株M-1在pH6.5时其酶活达到最高。因此，菌株M-1和M-2产蛋白酶的最适初始pH值分别确定为6.0和6.5。
土霉素菌渣无害化处理：筛选菌株的生长曲线及产蛋白酶条件（一）
土霉素菌渣无害化处理：筛选菌株的生长曲线及产蛋白酶条件（二）
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