CYP720B1基因突变型莱茵衣藻提高铜离子耐受性及吸附效率
重金属元素在人们的日常生活中广泛存在，由于其在农业、工业与医疗业的普遍应用使得它们在土壤以及水体中均有所分布。在过去的几年中，由于重工业的飞速发展，重金属污染的土壤明显增加，由于重金属污染难以通过物理或化学方法有效降解，它们对地球的生态环境以及人类的身体健康造成严重的影响。而重金属污染的水体一方面如果直接饮用可能会造成一些疾病甚至死亡，另一方面会通过各种食物链逐级递增，富集到人体中，影响身体健康。因此，解决这样的重金属污染是重中之重。
铜是一类过度金属，它的原子序数为29，原子量为63.5，也是世界上第三大的常用金属。铜对于植物与动物的生长都具有不可替代的意义。在人体中，铜能够促进血红蛋白以及血红素的生成，维持正常的造血功能。除此以外，铜对于抗氧化作用以及维持中枢神经系统的完整性也有着重要作用。然而，当铜过量时，往往会引起较为严重的氧化应激和组织损伤。一般情况下，与铜毒性相关的氧化应激部分是其氧化还原反应性的结果，例如游离铜或低分子量铜配合物催化超氧阴离子与过氧化氢之间产生羟基自由基，此外，铜也可以直接与半胱氨酸的游离硫醇结合，引起蛋白质氧化损伤活性。当人体摄入大量铜盐时，往往会产生急性中毒的现象，患者会头晕、呕吐、腹痛、心跳加速、呼吸困难、溶血性贫血甚至肝肾衰竭死亡。当摄入的铜在组织中过量时，可能会引起威尔逊氏病(Wilson's Disease)，如果能及时识别这种疾病，就可以采用低铜饮食或者螯合剂来缓解甚至治疗，但是如果不多加干涉，往往会引起肝衰竭。此外，在大脑区域铜过量还会引起一些神经退行性疾病，比如阿尔兹海默症(Alzheimer's Disease)等，一些研究认为金属稳态失调是引起阿尔兹海默症的重要因素，铜离子与β淀粉样蛋白的配合物催化活性氧的产生导致氧化损伤在阿尔兹海默症中的病理发生中起着重要作用。
铜的最大浓度水平需要严格的调控，这就要求人们能够使用合理的方法治理铜污染。一般来说，化学沉淀法是最为常用的策略，向铜污染水中加入沉淀剂，金属阳离子与沉淀剂反应从而形成不溶性物质，与水完成分离，这种方法成本不高，能耗较低，操作也较为安全，但是处理后会产生大量淤泥，需要处置这种淤泥的成本较高，并且如果重金属离子的浓度较低的情况下，使用化学沉淀法也难以见效。此外，离子交换技术也可以用于除去重金属，通过离子交换树脂与废水中的金属交换阳离子的能力来去除水体中的重金属，这种方法没有淤泥产生，去除重金属的能力强，同时对去除的重金属还有一定的选择性，但是用于离子交换的树脂需要再生，而再生液的处理成本十分高昂。除了这两种方法外，混凝、膜过滤、电化学方法、吸附也都是常用的去除重金属的技术。相比于这些传统方法，生物修复因其支持环境可持续性和经济循环而成为一种更具有竞争力的修复技术，微生物用于重金属离子的吸附更为广泛。微生物进行金属吸附一般包括两个阶段，第一个阶段金属离子与细胞表面无活性的组分结合，独立于细胞代谢过程，而第二个阶段是将金属离子吸附进入细胞质中，这个阶段涉及细胞代谢过程。藻类细胞表面存在多种类型的金属离子结合基团，包括羟基、羧基、磷酰基、胺、咪唑等等，这些结合基团使细胞表明的净电荷为负，更有利于吸附重金属离子。
莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种常见的单细胞微生物，已完成全基因组序列测序，培养周期短，并且对金属胁迫有着较高的耐受性，目前广泛用于金属修复以及生态毒理学的研究中。莱茵衣藻有多种方式抵御重金属胁迫，在其细胞表面有着细胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances，EPS)，细胞外聚合物由多糖、蛋白质、核酸和腐殖质组成，具有较强的结合金属离子的能力，因此，金属离子会与细胞壁以及细胞外聚合物结合，从而达成积累金属的效应。其次，莱茵衣藻细胞能够通过膜转运调节以及细胞内络合维持金属稳态，在莱茵衣藻细胞内，有A组转运蛋白以及B组转运蛋白，A组转运蛋白将金属离子转运至衣藻细胞质内，而B组转运蛋白将衣藻细胞质中的金属离子转运至细胞器中。莱茵衣藻也能够通过植物螯合肽、硫氧还蛋白、谷胱甘肽等大分子物质降低重金属对细胞的毒害。
在基因突变技术日渐成熟的今天，许多研究者能够构建莱茵衣藻新的突变株在全基因组范围内进行基因遗传或功能鉴定，从而更好地研究突变基因在莱茵衣藻抗铜功能中所起的作用。
CYP720B1基因突变型莱茵衣藻对水溶液中铜离子耐受性及吸附效率鉴定方法，包括以下步骤：
(1)衣藻在Cu2+胁迫下的生长状态：
按照衣藻细胞的培养方法，从新鲜的TAP平板上挑取野生型、突变体，将细胞培养到S1代。在超净工作台内取样计数，然后用灭过菌的50mL离心管2500rpm，离心3min。将所有的细胞收集，用新鲜的TAP培养基重悬成浓度为1×108cell/mL的细胞悬液。将灭过菌的0.1M的Cu2+溶液分别添加0、200、400、600、800、1000μL到吹气瓶中，在吹气瓶中加入2mL浓度为1×108cell/mL的细胞悬液。然后用新鲜的TAP液体培养基将每个吹气瓶中的液体补齐到200mL，获得分别用0、100、200、300、400、500μM Cu2+TAP培养基处理的衣藻细胞。将处理好的细胞放置在光照培养箱内光周期培养，然后按1、2、3、4天的时间点取样计数，绘制生长曲线，结果如图1所示。从图中可以看出，发现CYP720B1基因突变型莱茵衣藻具有高生长速率，且具有较高的铜离子耐受性；野生型WT藻株生长速率较慢，且容易受到铜离子的生长抑制作用。
图1野生型细胞株WT(a)与突变型细胞株CYP720B1(b)分别在Cu2+浓度为0-500μM的细胞生长速率图；
(2)Cu2+吸附效率测定：
按照衣藻细胞的培养方法，从新鲜的TAP平板上挑取野生型、突变体，将细胞培养到S1代。在超净工作台内取样计数，然后用灭过菌的50mL离心管2500rpm，离心3min。将所有的细胞收集，用纯水清洗3遍，每次2500rpm，离心3min。最终用纯水调成浓度为1×107cell/mL的细胞悬液。设定不同的吸附时间长度(0.25、0.5、1、2、3、4h)。将对应吸附时间点的样本分别转移至EP管内，6000g室温离心1min取上清，并做好标记。将上述样品加入新的24孔板中，对金属液浓度超过75μM的样品进行稀释，再按照国标法加入对应试剂等待显色完成，然后用酶标仪检测OD457的吸光值。将酶标仪测定的吸光值代入标准曲线中，获得不同上清样品Cu2+浓度数据，将获得数据导入GraphPad软件，绘制统计图，结果如图2所示。从图中可以看出，CYP720B1基因突变型莱茵衣藻在同等吸附时间和铜离子浓度条件下，比野生型WT藻株具有更高的吸附效率。
野生型细胞株WT与突变型细胞株CYP720B1分别在Cu2+浓度为0-500μM的细胞吸附效率图
结论
总之，依托于莱茵衣藻的野生型细胞株，从莱茵衣藻野生型细胞株构建的随机突变体文库中经铜离子耐受性细胞筛选及基因鉴定，鉴定获得了具有铜离子耐受功能调控的基因CYP720B1，该基因突变后导致衣藻细胞株的铜离子胁迫下的生物量增加显著并且具有提高的铜离子吸附效率。依赖于后期研究，可期望解析该基因如何参与重金属铜离子生物代谢等过程，并初步构建基于该基因的基因工程化衣藻细胞用于重金属铜离子型污水的生物修复及农业水资源循环利用领域。
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