茯砖茶中金花菌菌落标准计数方法优化条件【试验】（一）
茯砖茶内部或表面存在大量金黄色颗粒状物质，俗称“金花”；其数量的多少是判断茯砖茶品质好坏的重要指标。由于地域的差异性，金花菌具有多样性，但大都以冠突散囊菌为主，还包括谢瓦式散囊菌、阿姆斯特丹散囊菌、间型散囊菌及肋状散囊菌等。其子囊果均为闭囊壳型，他们的共同特征是：培养前期（5 d～6 d），菌落质地紧密，中心颜色为黄色或棕褐色，周边为浅黄色。目前，对金花菌的检测一般均采用GB/T 4789.15-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》，该方法针对的是食品中霉菌和酵母菌的计数，而金花菌闭囊壳很难破裂，形成的菌落可能是2个～3个或更多个孢子生长发育而成，因此采用国标方法并不能准确地反映茯砖茶中金花菌的数量。
本试验通过响应面法建立多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，充分考虑各因素之间的影响，通过前处理条件使金花菌闭囊壳充分破裂释放子囊孢子，从而得到金花菌菌落总数计数的优化条件，为以后建立茯砖茶中金花菌标准计数方法提供试验依据。
1材料与方法
1.1材料与设备
原料：茯砖茶，由咸阳泾渭茯茶有限公司提供。
FW100高速万能粉碎机：天津泰斯特仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸气灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司；SW-CJ-ID单人单面净化工作台：上海树立仪器仪表有限公司；GHP-90隔水式恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；HZQ-C双层空气浴振荡器：哈尔滨东联电子技术开发有限公司。
培养基：孟加拉红培养基，按GB/T 4789.15-2016配制。
1.2方法
1.2.1样品的准备
采用GB/T 8302-2013《茶取样》方法取样。将整块茶砖撬碎混匀，取部分混匀茶样粉碎后备用，部分不粉碎茶样作为对照样品。
1.2.2菌落计数方法
采用GB/T 4789.15-2016方法。取已准备好的茶样25.00 g于装有无菌稀释液的三角瓶中（内含200颗玻璃珠），经振摇后进行梯度稀释，孟加拉红培养基倾注平板，平板于（28±1）℃恒温培养箱培养，第5天计数并拍照记录。
1.2.3单因素试验
1.2.3.1筛子目数对金花菌菌落总数的影响
茶样粉碎，分别过筛40、50、60、70、80、90目，分别称取过筛后的茶样25.00 g于无菌蒸馏水中，振摇30 min（200 r/min）后进行梯度稀释，孟加拉红培养基倾注平板，（28±1）℃恒温培养箱培养，第5天计数。
1.2.3.2无菌稀释液浓度对金花菌菌落总数的影响
称取过筛60目的茶样25.00 g，分别加入无菌的蒸馏水、0.45%NaCl、0.85%NaCl、1.25%NaCl、1.65%NaCl、磷酸缓冲溶液中稀释，振摇30 min（200 r/min）后进行梯度稀释，孟加拉红培养基倾注平板，（28±1）℃恒温培养箱培养，第5天计数。
1.2.3.3振摇时间对金花菌菌落总数的影响
称取过筛60目的茶样25.00 g于无菌蒸馏水中，在转速为200 r/min条件下，分别振摇20、30、40、50、60、70 min后，进行梯度稀释，孟加拉红培养基倾注平板，（28±1）℃恒温培养箱培养，第5天计数。
1.2.4响应面试验
在单因素试验基础上，以筛子目数、NaCl浓度、振摇时间为自变量，以金花菌菌落总数为响应值进行响应面试验，中心试验重复5次，共17个试验点，试验设计如表1所示。
表1因素水平表
2结果与分析
2.1单因素试验结果
2.1.1筛子目数对金花菌菌落总数的影响
筛子目数对金花菌菌落总数的影响见图1。
图1筛子目数对金花菌菌落总数的影响
由图1可知，筛子目数对金花菌菌落总数影响显著。随着筛子目数的减小，金花菌菌落总数呈增长趋势，筛子目数从40目至80目，金花菌菌落总数呈直线增长，筛子目数为80目时，其菌落总数为（45.8±1.5）×105CFU/g；80目至90目，金花菌菌落总数趋于平缓，原因可能是高速粉碎机在粉碎过程中高速撞击并产生热量，当粉碎时间过长时容易导致金花菌孢子结构被破坏而失活。因此，筛子目数选用80目。
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