不同质量浓度水飞蓟宾对6种标准菌株的生长抑制曲线（一）
摘要：目的探讨水飞蓟宾及同分异构体的体外抗菌谱及水飞蓟宾与临床常用抗生素的联合抑菌效应。方法用微量肉汤稀释法测定水飞蓟宾及同分异构体对临床感染常见细菌的6种标准菌株和6种临床分离菌株（74株）的最低抑菌浓度（MIC）。用平板菌落计数法测定不同质量浓度水飞蓟宾对6种标准菌株的生长抑制曲线。
用棋盘微量肉汤稀释法进行水飞蓟宾与临床常用抗生素的联合药敏试验，计算联合抑菌指数（FIC），判定水飞蓟宾与抗生素的联合抑菌效应。结果水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌标准菌株的MIC为50～400μg/mL，对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌标准菌株的MIC均＞400μg/mL；对表皮葡萄葡萄球菌临床分离菌株的MIC分别为100、200、400、＞400μg/mL，对金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌临床分离菌株的MIC分别为400、＞400μg/mL；对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株的MIC均＞400μg/mL。水飞蓟宾其他同分异构体对6种标准菌株的MIC为≥400μg/mL。水飞蓟宾对表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌标准菌株的生长曲线都有明显抑制作用，抑制效果随药物质量浓度增加而增加，对大肠埃希菌和铜绿假单胞菌标准菌株的生长曲线无影响。水飞蓟宾与青霉素/红霉素联用对革兰阳性试验菌的FIC以0.5＜FIC≤1和1＜FIC≤2为主，水飞蓟宾与环丙沙星或庆大霉素联用对革兰阴性试验菌的FIC以FIC＞2或1＜FIC≤2为主。结论水飞蓟宾对革兰阳性菌有较好的抑菌活性，其中对表皮葡萄球菌抑菌活性最强。水飞蓟宾的抑菌活性明显高于其他同分异构体。水飞蓟宾与青霉素/红霉素联用主要为相加和无关作用，与环丙沙星或庆大霉素联用主要为拮抗或无关作用。
随着抗生素的广泛使用，细菌耐药性给临床抗感染治疗带来严峻挑战，已经成为21世纪全球公共卫生面临的重大问题[1-5]。相比耐药菌的迅速增加，近年来抗菌药物的研发速度明显减慢，未来临床可能会出现无药可用的局面。目前人们已将视线投向天然药物[6]，中草药因其来源广泛、价廉、毒副作用小及不易出现耐药性，而成为新抗菌药物研发的热点[7-8]。
中药抑菌杀菌的有效成分多样，包括有机酸、挥发油、生物碱、多糖类、黄酮类、萜类、醌类等，从植物花、叶、种子、果实、根、茎中提取的黄酮类化合物具有直接抑菌、协同抑菌及抑制细菌毒性等作用，其抑菌活性与分子结构有关，自然界中不同来源及不同种类的黄酮类化合物分子结构各异，抑菌谱和抑菌活性各不相同[9-11]。水飞蓟种子皮的初级总提取物水飞蓟素为黄酮本质素类化合物，包括紫杉醇、紫杉醇衍生物、水飞蓟亭、水飞蓟宁、水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、异水飞蓟宾A、异水飞蓟宾B和脱氢水飞蓟宾9种成分，主要活性成分为水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁4种同分异构体，其中水飞蓟宾含量最高（60%～70%），并对金黄色葡萄球菌有抑制作用[12]。中药成分复杂、作用机制广泛，分离纯化得到有效单体并研究其药理作用是现代中药开发应用的基础。目前水飞蓟宾作为保肝药物广泛应用于临床[13-14]。但关于水飞蓟宾及同分异构体的抑菌谱及其与抗生素联合抑菌效应的报道极少。本实验采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和联合药敏实验，探讨水飞蓟宾及同分异构体的抑菌谱及其与临床常用抗生素的联合抑菌效应，为新抗菌药物的开发和研制提供科学依据，为黄酮类药物的进一步开发应用提供基础。
1、材料
1.1药物与试剂
水飞蓟宾（质量分数＞98%，批号Y-024-150422）、水飞蓟宁（质量分数＞98%，批号S-112-170418）、异水飞蓟宾（质量分数＞98%，批号Y-138-161201）、水飞蓟亭（质量分数＞97%，批号S-111-170418）均购自成都瑞芬思生物科技有限公司；青霉素、红霉素、庆大霉素和环丙沙星标准物质购自中国食品药品检定研究院；M-H肉汤培养基粉末购自青岛高科园海博生物技术有限公司；营养琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；Costar®96孔细胞培养板为美国Corning-Costar产品。
1.2菌株
1.2.1标准菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、表皮葡萄球菌ATCC12228、粪肠球菌ATCC29212、屎肠球菌ATCC19434、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853，购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心-菌种保藏中心。
1.2.2临床分离菌株金黄色葡萄球菌15株、表皮葡萄球菌10株、粪肠球菌4株、屎肠球菌15株、大肠埃希菌15株、铜绿假单胞菌15株，均收集于四川省中医院。
2、方法
2.1水飞蓟宾及同分异构体药液配制
用二甲基亚砜将水飞蓟宾及同分异构体样品溶解并配成80 mg/mL的母液，滤过除菌后4℃保存备用。使用时先用无菌MH肉汤将母液稀释100倍，再用MH肉汤进行倍比稀释为800、400、200、100、50、25、12.5μg/mL。
2.2抗生素溶液配制
用冰醋酸溶解红霉素，用蒸馏水溶解青霉素、环丙沙星、庆大霉素，配成800μg/mL母液，滤过除菌后4℃保存备用，使用时用无菌MH肉汤倍比稀释。
2.3细菌悬液制备
将菌株复苏于血琼脂平板上，37℃培养24～48 h，挑取单个纯菌落接种于无菌MH肉汤培养基中，37℃（100 r/min）振摇培养至对数生长期，用无菌MH肉汤稀释菌悬液至0.5麦氏浊度（1.5×108 CFU/mL），再用MH肉汤调节菌液浓度为1.0×106～1.0×107 CFU/mL。
2.4 MIC测定
采用美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的微量肉汤稀释法测定各受试样品的MIC。
2.4.1水飞蓟宾及同分异构体对标准菌株的MIC测定取96孔板，每孔加入100μL菌悬液和100μL不同质量浓度的供试药液（水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭和水飞蓟宁），使药物终质量浓度分别为400、200、100、50、25、12.5、6.25μg/mL，37℃（100 r/min）振摇培养18～24 h，以肉眼观察无细菌生长、培养液清澈的最低药物质量浓度为MIC。同时设阴性对照（无菌MH肉汤）和阳性对照（细菌＋无菌MH肉汤）。实验重复3次，取平均值。
2.4.2水飞蓟宾对临床分离菌株的MIC测定按“2.4.1”项方法操作测定。
2.4.3抗生素对标准菌株和临床分离菌株的MIC测定革兰阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌）选用青霉素、红霉素，革兰阴性菌（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌）选用庆大霉素、环丙沙星。按“2.4.1”项方法操作测定。
2.5水飞蓟宾对标准菌株的生长抑制曲线检测
取96孔板，每孔加入100μL菌悬液和100μL不同质量浓度的水飞蓟宾药液，使水飞蓟宾终质量浓度分别为0.5 MIC、1 MIC、2 MIC；菌阳性对照组用无菌MH肉汤替代药液（菌悬液＋无菌MH肉汤）。放37℃孵育箱中培养，分别于培养0、2、4、6、8、10、12、14、16 h取样进行平板菌落计数（按国标GB/T5750.12-2006）。将菌悬液按10倍递增稀释后，取目标浓度菌悬液1 mL加入一次性无菌平皿，再加入15 mL 50℃左右营养琼脂，立即混匀，待凝固后于37℃培养18～24 h，肉眼观察并记录每个平皿的菌落形成单位（colony forming unit，CFU）。以菌落数为30～300的平板，计算每毫升原始样品中所含细菌总数（1 mL原菌悬液中的活菌数＝全平板CFU×稀释倍数），每个浓度菌液同时做3个平行平板，CFU取3个平板的均值。当空白对照（只加无菌MH肉汤＋营养琼脂，不加菌悬液）平板上无细菌生长时，实验结果有效。以菌落总数为纵坐标，培养时间为横坐标绘制生长抑制曲线。
2.6水飞蓟宾与抗生素对标准菌株和临床分离菌株的联合药敏实验[15]
采用棋盘法。将水飞蓟宾及临床常用抗生素溶液（革兰阳性菌选用青霉素和红霉素，革兰阴性菌选用庆大霉素和环丙沙星）以MH肉汤倍比稀释成8个质量浓度，即4 MIC、2 MIC、1 MIC、1/2MIC、1/4 MIC、1/8MIC、1/16 MIC、1/32MIC。联合药物孔将不同质量浓度的水飞蓟宾药液与抗生素溶液两两组合加入96孔板，每种药液每孔各加50μL；抗生素或水飞蓟宾单药孔加相应单一药液每孔100μL；细菌生长阳性对照每孔加无菌MH肉汤100μL。再向每孔加入100μL菌悬液，振摇混匀后37℃培养18～24 h。记录抗生素单用MIC（MIC甲药单用）、水飞蓟宾单用（MIC乙药单用）和抗生素与水飞蓟宾联合应用MIC（MIC甲药联用和MIC乙药联用）。计算联合抑菌指数（fractional inhibitory concentration，FIC）＝MIC甲药联用/MIC甲药单用＋MIC乙药联用/MIC乙药单用。实验重复3次，取平均值。联合抑菌效应判定：FIC≤0.5，2种药物有协同作用；0.5＜FIC≤1，2种药物有相加作用；1＜FIC≤2，2种药物为无关作用；FIC＞2，2种药物有拮抗作用。
2.7数据统计学分析
统计学处理采用SPSS 23.0统计软件，计数资料以百分比表示。菌种间MIC值分布的总体比较采用Kruskal-WallisH秩和检验，两两比较采用单因素方差分析。FIC值分布的比较采用独立样本χ2检验，两两比较采用χ2分割法。
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