大肠埃希菌的菌落数范围、贮藏条件、活性及性状的稳定性【实验】
摘要：大肠埃希菌在4°中贮藏，其作为实验菌的活性。连续31天进行大肠埃希菌计数和特征实验，进而验证其数量及性状的稳定性。结果表明，在连续31天的实验中，大肠埃希菌的菌落数范围在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml，且菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出该菌种应有特性。实验证明，在4°冰柜贮藏条件下，大肠埃希菌能够作为对照菌进行控制菌检查法实验。
依据《中华人民共和国药典》2015版，非无菌产品微生物限度检查中的控制菌检查法，需进行阳性对照试验，每次试验均需要加入不大于100cfu的对照菌。依据药典指导原则，菌种可采用低温冷冻干燥、液氮贮存、超低温冷冻（低于-30℃）等保存方法。使用以上方法保存菌种，则需在每次实验前都要进行菌种活化和计数实验，进而配制不大于100cfu的加菌量。本公司药品均进行微生物限度检查，其中含有大肠埃希菌项目。为提高检验效率，寻找适宜的菌种贮藏方法，同时结合本实验室实际情况，将大肠埃希菌经复苏后接种至胰酪大豆胨液体培养基中，24h菌种活化后，4°C冰柜里贮藏。随后每日进行菌种数量及性状验证，为进行大肠埃希菌的贮藏提供有益的科学探讨。
1材料与方法
1.1仪器与材料
BPX-272型电热恒温培养箱;YSQ-LS-75SII型立式压力蒸汽灭菌器;生物安全柜;大肠埃希菌[CMCC（B）44102]购自中国食品药品检定研究院;实验所用培养基。
1.2实验方法
1.2.1菌液制备：复苏后的大肠埃希菌菌种（不超过5代）移至胰酪大豆胨液体培养基置培养箱中30～35°C培养24h，培养后贮藏至4°C冰柜。
1.2.2菌种计数：取1ml菌液用pH7.0蛋白胨缓冲液逐级稀释至10-10，取各级稀释菌悬液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45°C熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。30～35°C培养24h，然后用µCount3D微生物计数仪计数。
1.2.3性状验证：10-8稀释级菌液大肠埃希菌接种于麦康凯液体培养基（42～44°C培养24h）和麦康凯琼脂培养基（30～35°C培养24h）中，观察培养基上大肠埃希菌生长情况。
2实验结果
2.1菌种计数实验结果
由表1可以看出，大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天的菌落数范围在1.5×109cfu/ml～8.7×109cfu/ml之间。
2.2性状验证实验结果
由表2可以看出，大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天取菌液量均不大于100cfu，加入麦康凯液体培养基和麦康凯琼脂培养基中，培养基体现的菌落大小、形态特征、指示反应等情况均体现出大肠埃希菌应有特性（+表示）。
综上，将大肠埃希菌在4°C冰柜里贮藏，连续31天进行计数和性状实验。结果表明，取10-8稀释级菌液，每ml菌液量均不大于100cfu，这可用于大肠埃希菌检测阳性对照试验的加菌量，无需每次进行验证。同时，每ml10-8稀释级菌液也能够表现出大肠埃希菌應有特性。由此证明，每次进行大肠埃希菌实验，可直接用贮藏菌液稀释至10-8，取1ml作为阳性对照实验的加菌量。
3讨论
药品微生物限度检查是控制药品质量的一个重要检查项目，其中控制菌检查是必须进行的检验项目。控制菌检查过程中，需要添加不大于100cfu阳性菌进行阳性对照实验。按照冷冻法活化新鲜菌种，进而制备试验菌，其工作量较大，周期较长。现采用4°C冰柜贮藏大肠埃希菌菌液，每次可以直接进行稀释使用，提高工作效率，同时也可保障检验的顺利进行。本文只对大肠埃希菌进行实验，其他菌种（铜绿假单胞菌、沙门菌等）未进行相关实验，故是否能应用于所有控制菌实验还需进一步研究。