不同光照、pH条件对血红密孔菌培养过程中生物量、总抗氧化能力的影响（一）
药用真菌是很重要的中药来源之一，具有降血脂、抗肿瘤、改善机体免疫力等多种功效。真菌能够在其生长过程中产生大量的生理活性物质，主要包含黄酮、多酚、多糖、有机酸、甾体、萜类与多肽等，具有很好的抗肿瘤、抗氧化等活性，且毒副作用较低。红平菇多糖能够通过增强抗氧化酶活性、清除肝脏中释放的自由基阻断氧化链反应来缓解由四氯化碳诱导的急性肝损伤，保护肝脏；研究发现香菇菌丝体多糖可通过提高机体抗氧化能力来缓解由苯酚诱导的大鼠口腔溃疡，减轻其炎性反应。研究发现，银耳多糖可通过降低血小板数目，减少黏附率，起到抗血栓的作用。灵芝三萜化合物能够通过激活ERK和JNK促分裂原激活蛋白激酶，促使肝癌细胞HuH-7凋亡。血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)是担子菌纲、多孔菌科、密孔菌属的一种白腐真菌。具有杀灭细菌、抑制肿瘤、消炎止血等作用。研究发现血红密孔菌的次级代谢产物色素具有抑制革兰阳性菌的作用；当液态培养血红密孔菌色素质量浓度为4.32μg/mL时，抑菌率高达98%。密孔菌可作为食品应用于保健品的开发，也可用于治疗皮肤损伤。目前对血红密孔菌的研究多集中在木质纤维素类原料生物转化方面，而培养条件(光照和pH)对血红密孔菌生长及抗氧化活性影响的研究并不多见。不同的培养条件尤其是光照和pH，对真菌生长，抗氧化能力都有较大影响。连续两周的光照条件及pH 9时对真菌多酚含量的影响较大，抗氧化能力达到最高，约为其他条件的1.2倍和1.5倍。24 h光照条件下，忍冬纤孔菌生物量较低，但DPPH自由基的清除能力相对较高，约为其他条件的0.6倍和1.2倍；在初始培养液pH分别为5及3条件下，菌丝体生物量和提取物活性均达到最高，最高可达其他条件的1.5倍和3倍；光照条件下桦褐孔菌生物量比黑暗中的低，而DPPH自由基清除活性则比黑暗条件下高。生物抗氧化能力主要是清除自由基，目前自由基清除能力分析的常用方法是DPPH法，该法也是评价物质体外抗氧化活性的重要方法。本研究通过对血红密孔菌的培养，对不同光照和pH条件下血红密孔菌的生物量、DPPH自由基清除能力和总抗氧化能力进行分析，为进一步优化血红密孔菌培养条件提供参考，也支持了进一步探究其药理药效。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种来源血红密孔菌(Pycnoporussanguineus)，购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC 51180)。
1.1.2培养基(g/L)①固体PDA培养基：马铃薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,琼脂20,水1 000 mL，pH自然。②液体PDA培养基：马铃薯200，葡萄糖20，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 1,水1 000 mL，pH根据实验需要调节。
1.2方法
1.2.1菌种活化与培养菌种接种于固体PDA培养基上，28℃培养7 d后转接到液体PDA培养基中摇床培养，28℃、150 r/min培养7 d，取出留作后续实验使用。
1.2.2不同光照与pH条件培养①光照对血红密孔菌的影响：用灭菌后的匀浆器打碎活化后的菌体发酵液，经充分振荡后以2%的接种量接种到250 mL锥形瓶中(含有100 mL液体PDA培养基，pH自然)，设置14 d黑暗(D)、14 d光照(L)和1 d黑暗、1 d光照(DL)交替3种光照条件，设3个平行，每2 d取样，于恒温摇床28℃、150 r/min培养。②pH对血红密孔菌的影响：用灭菌后的匀浆器打碎活化后的菌体液，经充分振荡后以2%的接种量接种到100 mL液体PDA培养基(已分别调节pH至3.0、5.0、7.0、9.0)，28℃、150 r/min黑暗条件下培养14 d，设3个平行，每隔2 d取样检测。
1.2.3菌体及上清收集每2 d取样，8 000 r/min离心15 min；收集菌体60℃烘干至恒重，称量记录不同培养条件下菌体生物量，生物量(g/L)=菌丝体干重(g)/发酵液体积(L)；收集上清液用于DPPH自由基清除能力检测、胞外T-AOC含量检测。
1.2.4总抗氧化能力检测采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。待测样品分为测定管与对照管，测定管中依次加入相关试剂及待测样品；对照管中除不加入待测样品外，其余同测定管一致。37℃充分反应30 min后，各加入显色剂(对照管中另加入待测样品)分别充分混匀；于520 nm波长下，测定各管吸光度值。总抗氧化能力计算公式：
总抗氧化能力(U/mL)=
1.2.5 DPPH自由基清除能力检测收集不同培养条件下的上清各100μL于96孔板中，并向每孔中加入100μL 2.0×10-4mol/L的DPPH溶液，混匀后室温避光放置30 min，于517 nm波长处检测各孔的吸光值，清除率计算公式：
清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%
式中：Ai为DPPH溶液与样品混合后溶液的吸光值；Aj为样品溶液的吸光值；A0为DPPH溶液的吸光值。
1.2.6统计学分析所得的结果数值均以平均值及标准差表示，数据用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，P<0.05时为差异显著。
2结果与分析
2.1不同光照及pH条件对血红密孔菌生长过程中生物量变化的影响
2.1.1光照不同光照培养条件下，血红密孔菌生物量均基本呈上升趋势(图1)。14 d光照条件下，生物量先上升至第8天为2.68 g/L，于第10天有所下降，后又升至2.92 g/L(第12天)，后于第14天略降至2.28 g/L;1 d光照1 d黑暗交替条件下，生物量于第2～12天略有升高，并在第14天最终达到2.94 g/L;14 d黑暗条件下，第2～10天血红密孔菌的生物量处于缓慢上升状态，并于第10天～12天生物量大幅上升，随后缓慢上升并于第14天达到最大值，为4.49 g/L。综上所述，14 d黑暗条件更利于血红密孔菌的生长，于第10～14天生长过程中，其生物量均明显高于14 d光照组及14 d光照黑暗交替组且差异显著。
图1不同光照条件对血红密孔菌生物量的影响
2.1.2 pH值在血红密孔菌的生长过程中，不同pH条件对其生物量的影响较大(图2)。当pH为3时，生物量于第4天达到最大值4.89 g/L，后续保持基本平稳状态；当pH为5时，生物量一直上升至第10天，达最大值7.12 g/L，随后略有下降，第14天下降至6.49 g/L；当pH为7时，生物量从第2～4天保持平稳，从第4～12天处于上升状态，于第12天达最大值5.70 g/L，随后有所下降，降至5.48 g/L；当pH为9时，生物量从第2～14天基本保持升高，并于第14天达最大值6.19 g/L。综上所述，pH为5时，血红密孔菌的生物量增长最大且后期(第8～14天)较其余3组增长明显。因此，pH 5更适于该菌的生长。
图2不同pH条件对血红密孔菌培养过程中生物量的影响
不同光照、pH条件对血红密孔菌培养过程中生物量、总抗氧化能力的影响（一）
不同光照、pH条件对血红密孔菌培养过程中生物量、总抗氧化能力的影响（二）
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