快速药敏检测方法、发展现状|拉曼光谱在RAST领域中的应用（二）
3拉曼光谱技术在RAST领域中的应用
3.1基于单细菌分子表型的RAST
基于单细菌分子表型的RAST可以省去细菌增殖所需时间。目前,基于单细胞水平的快速分子表型的药敏检测,主要依赖于活细菌对重水(D2O)的代谢摄入,生成细菌内部的生物分子,比如脂质和蛋白质等,通过检测C-D峰的强度可以实现抗菌药物MIC的快速检测。
C-D峰位于拉曼光谱的2 040～2 300 cm-1波段,该波段通常在未进行D2O标记的细菌中无可检测到的拉曼峰,具有高特异性。见图1。此外,在含有D2O的培养基中生长的细菌C-D峰的强度变化与活细菌的代谢活性呈正相关。
图1铜绿假单胞菌在正常和含D2O的培养基中培养
任何活细菌的代谢都需要水,因此,在含有D2O的培养基中生长的活细菌都会生成代谢表征的C-D峰,这决定了C-D峰可作为分辨单细菌细胞代谢活动的通用生物标志物。在基于培养的药敏检测方法中,细菌增殖一代的时间比开始出现代谢表征的时间长,而且不同种细菌的生长时间差异也会使药敏时间难以缩短,因此,基于C-D峰的单细胞拉曼药敏检测方法在RAST领域中有着极好的应用前景。
在目前的研究中,运用单细胞拉曼技术进行MIC的快速测定大致分为3步:(1)细菌在含有不同浓度梯度抗菌药物的培养基中先孵育1～2 h;(2)按体积比向培养基中加入D2O(目前报道30%～100%D2O浓度),同时保证培养基浓度和药物浓度与初始一致,继续孵育30 min左右;(3)根据耐药组和敏感组的相对C-D比,即C-D/(C-H+C-D)来设定cut off值以测定MIC。
3.1.1运用CRS技术进行RAST
TAO等证明了基于D2O活菌代谢标记的单细胞拉曼光谱可以检测细菌对抗菌药物的反应,2 040～2 300 cm-1波段的C-D拉曼带可作为单细菌代谢活性的通用生物标志物。YANG等开发了适用于临床尿液标本直接药敏检测的单细胞拉曼光谱技术,基于活菌的D2O代谢掺入,通过相对C-D比设置S/R截止值用于药敏结果判读,达到了从接收尿液标本到结果读取总检测时间缩短至2.5 h,且准确度高的效果。YUAN等将31株伊丽莎白菌分别与8种不同浓度抗菌药物和40%D2O共孵育,4 h即可测定抗菌药物的MIC,除头孢吡肟外,其他7种抗菌药物的单细胞拉曼药敏结果与金标准药敏结果一致率为94%。在该研究中,头孢吡肟所测药敏结果与金标准结果不一致可能是因为不生长但代谢活跃的细菌存在,这种特性可能会影响药敏结果的准确性,也会成为细菌感染治疗后复发的根源。因此,临床可以通过单细胞拉曼药敏检测技术来评估抗菌药物疗效,更好地指导临床给药。
3.1.2运用SRS技术进行RAST
快速准确的药敏试验对于多药耐药菌的安全、有效和环境友好型治疗至关重要。ZHANG等利用飞秒受激拉曼散射成像对经过70%D2O培养基和不同浓度抗菌药物孵育后的细菌进行单细胞成像,在不到2.5 h测定了14种抗菌药物对临床常见8种病原菌的MIC值,与金标准药敏结果的符合率为94.6%。此外,该研究制备了模拟尿液和血液标本,通过直接过滤的方法分离细菌进行药敏检测,准确度良好。此外,ZHANG等在单细胞水平上,通过SRS成像监测抗菌药物作用下的D2O活菌代谢掺入,在2.5 h内测得抗菌药物的单细胞代谢失活浓度。该方法还适用于尿液或血液等复杂生物标本的直接RAST。
3.2基于多细菌分子表型的RAST
虽然基于单细菌分子表型的RAST方法具有一定优势,但由于细菌是活体,同种菌的不同个体状态在不同时间或空间可能不同,这会影响药敏结果的准确性。因此,有研究者开发了基于多细胞水平分子表型检测的RAST方法,这种方法主要依赖于SERS技术。CHANG等开发了集成膜过滤和SERS活性衬底的微流控系统,微通道内腔室的膜可过滤和浓集细菌,注射泵将培养基、抗菌药物和洗涤液等注入其中,在过滤室中培养细菌,细菌释放的代谢物被输送到附着SERS衬底的微通道中进行检测,药敏检测时间明显缩短。FU等筛得一种带负电荷的适配子,与细菌特异性结合,利用粗糙金属纳米颗粒的信号放大作用,测定了大肠埃希菌O157∶H7和金黄色葡萄球菌在不同浓度抗菌药物作用下的拉曼光谱,首次发现735 cm-1可作为标志峰位置,基于此峰强度的变化,在1 h内可测得药物的MIC。HILTON等将纳米银颗粒印在SERS纸传感器上,利用便携式拉曼光谱仪对不同β-内酰胺类抗菌药物耐药的大肠埃希菌进行检测,在2.5 h内即可完成大肠埃希菌的耐药分析。新型RAST技术汇总见表1。
表1新型RAST技术汇总
4结论与展望
基于细菌生长和代谢表型的RAST技术相较于传统药敏方法的检测时间明显缩短,其中,运用拉曼光谱技术在细菌代谢表型水平进行RAST具有很好的应用前景。
虽然微流控、电阻抗和SYBR GreenⅠ活菌染色等技术平均药敏检测时间为1 h左右,但适用的细菌和抗菌药物都比较局限,也无法识别菌群中的异耐药菌,而且检测结果的准确性缺乏大标本量的验证。此外,这些基于生长的药敏检测对细菌的初始接种量有要求,而且细菌在刚接种到培养基中会经历1～3 h的迟缓期,很难检测到数量上的微弱变化,还易受到细菌本身状态和环境等因素的影响。
基于RNA测序的药敏检测目前只对环丙沙星作用于大肠埃希菌有研究,虽然其属于细菌代谢表型检测的RAST,但操作复杂,初始菌量要求高,难以满足临床要求。基于单细菌和多细菌代谢表型的RAST技术准确度高、灵敏度高,但仍有许多不足之处:(1)缺乏大规模临床分离株和抗菌药物的验证;(2)缺乏标准化的检测流程、不能做质控和室间比对等;(3)细菌个体的异质性会影响单细菌药敏检测的准确性;(4)对于SERS的药敏检测,增强基底合成复杂,容易受到残留培养基和其他成分的干扰,可重复性低等;(5)适用的标本类型局限于纯培养菌落、尿液和全血标本,而对于复杂的痰液、粪便等标本的直接药敏检测鲜有研究。
未来还需要对基于细菌生长和代谢表型检测的RAST技术进行大量的临床分离株和抗菌药物验证,并对检测结果的准确性进行评估;其次是标本处理流程的标准化,做好质控和室间比对,提高检测的可重复性和临床适用性;进行拉曼光谱药敏检测时要引入合适的内标,消除复杂因素对检测的影响,也可以将拉曼光谱与电阻抗、微流控、化学染色等技术相结合,开发更快、更准确、重复性更好的RAST方法,实现在复杂标本中直接进行细菌快速鉴定及药敏检测。